抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法.docVIP

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法

超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）

1、试剂的配制

（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；

B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。网上说定容到100ML我也不懂。拜托

（3）100μmol/LEDTA-Na2溶液：取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；

（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍

（5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存；

酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加2ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。

提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。

2、酶活性测定

2．显色反应取试管（要求透明度好）5支，3支为样品测定管，1支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。

混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。

表39-1各溶液加入量

试剂（酶）

用量(ml)

终浓度（比色时）

0.05mol/L磷酸缓冲液

130mmol/LMet溶液

750μmol/LNBT溶液

100μmol/LEDTA-Na2液

20μmol/L核黄素

酶液

蒸馏水

总体积

1.5

0.3

0.3

0.3

0.3

0.05

0.25

3.0

?

13mmol

75μmol

10μmol

2.0μmol

空白和对照管加缓冲液代替酶液

?

?

加核黄素时记得要快并且要避光，

SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其它各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性：

SOD总活性=

式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg蛋白表示；

A0—照光对照管的消光度值；

AS—样品管的消光度值；

VT—样液总体积（ml）；

V1—测定时样品用量（ml）；

FW—样重（g）；

蛋白质浓度单位为每克鲜重含蛋白毫克数(mg/g)。

用荧光灯20w照20min可以吗不可以,

二、POD、CAT酶活性的测定

粗酶液制备同SOD。

过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）

（1）试剂配制：

100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A母液(Na2HPO4)61.5ml和B母液(NaH2PO4)438.5ml混匀即为1000mlPBS(0.2M，pH6.0)；

（2）反应混合液配制：

取50mlPBS(100mmM，pH6.0)，加入28ul愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷