免疫组化知识点梳理汇总.docVIP

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主要实验耗材和试剂

盖玻片，载玻片，塑料包埋盒/PlasticEmbedBox，切片刀，切片储存盒/plasticbox，磷酸缓冲溶液/PBS，二甲苯，无水乙醇，苏木素染液（哈瑞氏），PBS缓冲液（pH7.2～7.4），柠檬酸盐缓冲液，多聚甲醛，过氧化氢，中性树胶，免疫组化试剂盒（这个用的是SABC）。

相关机器

组织脱水机，石蜡包埋机，冷台，染色，封片机，摊片机，烤箱，倒置荧光显微镜，微波炉，钢玻璃架。???????????

实验方法

1.实验样品的采集与固定

?（1）用活检针取组织块，轻置于含有4%中性多聚甲醛溶液的50ml离心管至少6个小时。组织与溶液的体积比小于1:20；

?（2）样品固定于新配制的中性多聚甲醛固定液（15ml离心管），24小时以上，使组织充分固定准备脱水。

2．组织脱水（使用组织脱水机）

??（1）装载组织前，确认仪器状态；确认所有石蜡和试剂缸的液体水平（位于最低刻度以上）；确认所有试剂未过期；确认组织脱水缸洁净。

??（2）装载组织：确认脱水组织的实验编号，包埋盒数量。将要脱水的组织包埋盒放入脱水篮，盖上脱水篮盖，再放入脱水缸中，盖上并锁紧脱水缸盖。

（3）程序选择及确定：确认并选择脱水程序。需要时可以使用延迟功能。

（4）脱水运行机。程序开始后，再次确认脱水程序设置。

（5）脱水程序结束后，及时将组织从脱水机内取出。

（6）运行清洗程序。

?通过Lecia?ASP200S全自动组织脱水机完成脱水过程；相关程序如下：

???a)?10%NBF5~6hr;

???b)?70%乙醇溶液45min;

???c)?80%乙醇溶液45min;

???d)?95%乙醇溶液45min;

???e)?95%乙醇溶液45min;

???f)?100%无水乙醇溶液45min;

???g)?100%无水乙醇溶液45min;

???h)?100%无水乙醇溶液45min;

???i)?二甲苯溶液60min;

???j)?二甲苯溶液60min;

???k)?石蜡60min;

???l)?石蜡60min;

???m)?石蜡60min;

?组织脱水机的试剂更换

LeciaASP200S脱水机在处理约800个包埋盒或运行6轮时，进行试剂更换。组织脱水机内有多缸的同种试剂（例如：无水乙醇，位于第6、7、8试剂站点），将第一缸试剂进行更换，并移至最后一缸（第6站移至第8站），其它两缸试剂不进行更换，分别向前移一缸（第7站移至第6站，第8站移至第7站）。组织脱水机内仅有一缸的其它试剂（例如70%乙醇溶液，位于第2站点）更换会原站点（第2站点）。

4.组织石蜡包埋

1.包埋前的准备

1.1Lecia组织包埋系统的组成及功能

?Lecia组织包埋系统由两部分组成：包埋台和冷冻台。包埋台包括左侧金属模具存放缸，右侧组织包埋盒存放缸及仪器上部的石蜡缸。包埋台前部有一个小小的冷台构成，迅速冷却包埋模具内的石蜡。包埋盒冷却后，蜡块保存在室温条件下。

（1）打开冷台。

（2）将脱水机中的包埋盒取出，放入包埋机蜡缸中。

1.2包埋

?（1）热镊子将包埋机拉缸中的组织包埋盒取出，放在包埋机的热台上。

?（2）用热镊子将组织放入包埋模具。

?（3）将与组织相应的包埋盒放置在模具上面。

?（4）再向包埋模具中加入少许溶解的石蜡，将包埋模具放在冷台上，直至石蜡彻底变成固体状态。

?（5）将固体的石蜡块从包埋模具中取出。

2.注意事项：

a.根据实验方案的需要有可能对一下的规程内容进行修改。

b.包埋时组织不应该接触模具的边缘，组织之间也不应该相互接触。

c.包埋的组织相对平滑的面应该朝向模具。

d.包埋不同大小组织时，应该先包埋较大的组织，然后包埋较小的组织。所有包埋的组织在包埋模具中应该在同一平面。

e.包埋过程中，应该保持镊子一直处于温热状态。在使用镊子后立即将镊子放入镊子加热处。

f.在开始包埋之前肉眼检查包埋机中的石蜡，石蜡不能被污染，包埋台必须保持清洁和没有肉眼可见的碎片。每次包埋结束后去除工作区域，仪器外部，热台溢出的石蜡和碎片。使用塑料的刮刀去除包埋机上的固态石蜡。

5.石蜡包埋组织块切片

1.切片机系统的组成

切片机系统由两个或三个模块组成：Lecia切片机，摊片机和冷台（适用时）组成。

?A.冷台的使用

?1.1使用前检查，包括电源情况。

?1.2打开冷台主电源，待冷台将至一低昂温度后将蜡块放于冷台上进行冷却。

?B.切片机的使用

?2.1装蜡块前，应确保切片轮把手（hangwheel）处于锁定状态，刀架保护套开启。清洁刀架上的蜡屑（存在时）。

?2.2小心插入未使用过的一次性切片刀片，确认刀片放入了刀架中的适当位置，根据生产商