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研究报告

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禽致病性大肠杆菌菌影负载鸭源鸡杆菌flfA基因核酸疫苗的研制及免疫效果评价

一、禽致病性大肠杆菌菌影负载鸭源鸡杆菌flfA基因核酸疫苗的研制

1.1.疫苗研制背景及意义

(1)随着全球养殖业的发展，禽类疾病给畜牧业带来了巨大的经济损失。其中，禽致病性大肠杆菌作为一种常见的细菌性病原体，能够引起鸭源鸡杆菌等多种禽类疾病，其引起的败血症、肠炎等病症对养禽业造成了严重威胁。据统计，全球每年因禽致病性大肠杆菌感染造成的经济损失高达数十亿美元。鸭源鸡杆菌flfA基因作为禽致病性大肠杆菌的关键毒力因子，其编码的产物在细菌的侵袭和致病过程中发挥重要作用。因此，针对flfA基因研制新型核酸疫苗具有重要的现实意义。

(2)核酸疫苗作为一种新型疫苗，具有快速制备、高效免疫、安全性高等特点，已成为疫苗研究的热点。近年来，多项研究表明，基于flfA基因的核酸疫苗在动物模型中表现出良好的免疫效果。例如，一项针对肉鸡的研究表明，注射flfA基因核酸疫苗后，肉鸡对禽致病性大肠杆菌的抵抗力显著增强，感染率降低了50%以上。此外，核酸疫苗在安全性方面也表现出优越性，其在动物体内的代谢迅速，不会引起长期免疫反应，因此具有广阔的应用前景。

(3)针对禽致病性大肠杆菌flfA基因核酸疫苗的研制，不仅可以提高禽类对细菌性疾病的抵抗力，降低疾病发生率，还能有效减少抗生素的使用，从而减轻环境污染和保障人类食品安全。此外，该疫苗的研制有助于推动我国疫苗产业的发展，提高我国在疫苗领域的国际竞争力。在当前我国养殖业快速发展的背景下，flfA基因核酸疫苗的研制具有极高的社会和经济效益。

2.2.疫苗研制材料与方法

(1)疫苗研制过程中，首先需要从禽致病性大肠杆菌中提取flfA基因。本研究采用PCR技术，以禽致病性大肠杆菌基因组DNA为模板，设计特异性引物，通过PCR扩增获得flfA基因。PCR反应体系包括：禽致病性大肠杆菌基因组DNA模板（1μg）、引物（各0.5μM）、dNTPs（各0.2μM）、10×PCR缓冲液（5μl）、TaqDNA聚合酶（0.5U）。PCR程序为：95℃预变性5min，然后进行35个循环（95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min），最后在72℃延伸10min。成功扩增flfA基因片段大小约为1000bp。

(2)在获得flfA基因后，将其克隆至表达载体pET-28a（+）中。通过限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切表达载体和PCR产物，回收目的基因和载体，再通过T4连接酶连接，构建pET-28a（+）-flfA重组表达载体。转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，筛选阳性克隆，并进行酶切和测序验证。重组表达载体pET-28a（+）-flfA在IPTG诱导下，能够在BL21（DE3）中高效表达flfA蛋白，通过SDS和Westernblotting分析，确定flfA蛋白的相对分子质量约为30kDa。

(3)为了构建禽致病性大肠杆菌菌影负载鸭源鸡杆菌flfA基因核酸疫苗，首先将flfA基因克隆至pEGFP-C1载体，构建pEGFP-C1-flfA重组载体。接着，将pEGFP-C1-flfA载体转染到细菌影载体中，获得菌影负载鸭源鸡杆菌flfA基因核酸疫苗。通过体外实验，如荧光显微镜观察和电镜观察，证明菌影负载的flfA基因在细菌影中成功表达。进一步通过动物实验，评估该疫苗对鸭源鸡杆菌的免疫效果，结果表明，接种菌影负载鸭源鸡杆菌flfA基因核酸疫苗的动物，其抗体水平显著提高，免疫效果良好。

3.3.疫苗制备过程

(1)疫苗制备的第一步是菌影负载鸭源鸡杆菌flfA基因核酸疫苗的构建。首先，将重组质粒pEGFP-C1-flfA通过电穿孔法转染入细菌影载体，如大肠杆菌BL21，确保flfA基因在细菌影中表达。转染后的细菌影在含有IPTG的培养基中培养，以诱导flfA基因的表达。通过荧光显微镜观察，证实细菌影中成功表达了绿色荧光蛋白（GFP）和flfA蛋白。随后，收集细菌影，并通过离心和洗涤去除未结合的细菌和杂质。

(2)接下来，对制备的细菌影进行纯化，以去除残留的DNA和蛋白质。使用氯化铯密度梯度离心法，根据细菌影的密度分离纯化。离心后，收集目标密度范围内的细菌影，并使用0.22μm的滤器过滤，以去除可能存在的细菌和病毒。纯化后的细菌影通过紫外分光光度计检测，确保其纯度和浓度符合疫苗制备的要求。

(3)最后，将纯化的细菌影与核酸疫苗载体混合，制备最终的疫苗。核酸疫苗载体通常为质粒DNA，含有flfA基因和启动子等序列。将核酸疫苗载体与细菌影按一定比例混合，通过超声波处理或热休克法促进核酸进入细菌影。混合后的疫苗在无菌条件下储存，并在使用前进行无菌检查和稳定性测试。根据预