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鸡球虫多价卵黄抗体IgY的制备及其抗球虫效果评价

一、鸡球虫多价卵黄抗体IgY的制备

1.3实验动物的选择与饲养

(1)实验动物的选择是制备鸡球虫多价卵黄抗体IgY的关键步骤之一。本实验选用健康的AA肉鸡作为实验动物，其生长速度快、抗病能力强，且卵黄抗体产量较高。选择时需注意鸡的年龄、性别和体重，通常选择6周龄左右的雌性鸡，体重在1.2-1.5公斤之间。同时，需对鸡进行健康检查，确保其无病原体感染，以保证实验结果的准确性。

(2)饲养环境对实验动物的生长发育和抗体产量具有重要影响。实验动物饲养在温度适宜、通风良好、光线充足的环境中，有利于提高其免疫力和抗体产量。具体饲养条件如下：室温控制在20-25℃，相对湿度在50%-70%之间，光照强度为200-300勒克斯，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。饲养笼具采用金属网笼，便于观察和操作。饲料选用全价配合饲料，保证营养均衡，每天定时定量喂食，自由饮水。

(3)在饲养过程中，要严格按照实验动物福利要求进行管理。定期对鸡进行称重、观察和记录生长情况，及时发现并处理异常情况。同时，要定期对饲养环境进行消毒，防止病原体滋生。在免疫接种前后，注意观察鸡的精神状态、食欲和粪便情况，确保实验动物的健康。此外，实验动物饲养期间，要严格遵守国家相关法律法规，确保实验的合法性和道德性。

二、抗原的制备与纯化

2.3抗原的鉴定

(1)抗原的鉴定是确保实验顺利进行和结果准确性的关键环节。在本研究中，我们采用了几种方法对鸡球虫抗原进行鉴定。首先，通过电泳技术对抗原进行初步分离和鉴定。具体操作是将抗原样品进行SDS电泳，然后将电泳后的蛋白条带转移到PVDF膜上。通过Westernblotting检测，使用鸡球虫特异性抗体进行孵育，观察特异性条带的出现。结果显示，在相对分子质量约为70kDa处出现了特异性条带，这与文献报道的鸡球虫抗原大小相符。

(2)为了进一步验证抗原的鉴定结果，我们采用ELISA技术对鸡球虫抗原进行定量分析。首先，制备抗原抗体反应板，将抗原包被于96孔板，然后加入鸡球虫特异性抗体，进行孵育。随后，加入酶标二抗和底物，检测抗体与抗原的结合情况。通过测定吸光度值，计算出抗原的浓度。结果显示，鸡球虫抗原的浓度为10ng/mL，与预期结果相符。此外，我们还对实验组鸡的粪便样品进行了ELISA检测，结果显示粪便中的鸡球虫抗原含量显著高于对照组，进一步证实了抗原的鉴定结果。

(3)为了验证抗原在免疫动物体内的诱导效果，我们选取了免疫鸡的血清进行抗体检测。采用间接ELISA方法，检测血清中的鸡球虫特异性抗体效价。结果显示，免疫鸡的抗体效价在免疫后第21天达到最高值，平均效价为1:25600。这与文献报道的抗体效价相符。此外，我们还对免疫鸡的卵黄进行了抗体检测，结果显示卵黄中的抗体含量为1:12800，表明免疫鸡通过卵黄传递抗体，为雏鸡提供了被动免疫保护。这些数据和案例表明，我们制备的鸡球虫抗原具有明确的生物学活性，可以作为制备多价卵黄抗体IgY的抗原。

三、免疫接种与抗体收获

3.3卵黄抗体的提取与纯化

(1)卵黄抗体的提取是制备多价卵黄抗体IgY的关键步骤。首先，将免疫鸡的卵黄从蛋中分离出来，然后将其与生理盐水混合，使用高速离心机进行离心处理，以去除蛋黄中的杂质。离心后的上清液即为含有卵黄抗体的溶液。在这个过程中，我们通常使用1500×g的离心速度进行15分钟的离心，以确保充分分离。

(2)提取到的卵黄抗体溶液接下来需要进行纯化。我们采用盐析法进行初步纯化，通过调整溶液的盐浓度，使IgY沉淀出来。具体操作是将卵黄抗体溶液与饱和硫酸铵溶液混合，搅拌后静置一段时间，待IgY沉淀后，通过离心收集沉淀。这一步骤可以去除大部分非特异性蛋白和杂质。

(3)初步纯化后的IgY沉淀需要进行进一步纯化，以提高抗体的纯度和活性。我们采用亲和层析法，利用鸡球虫抗原作为配基，固定在层析柱上。将纯化后的IgY溶液通过层析柱，使IgY与抗原结合，从而实现纯化。经过亲和层析的IgY，其纯度可达到95%以上。最后，通过凝胶过滤层析去除可能残留的杂质，确保最终产物的纯度和稳定性。

四、IgY的纯化与鉴定

4.3纯化效果的评估

(1)纯化效果的评估是确保鸡球虫多价卵黄抗体IgY质量的重要环节。在本研究中，我们采用了多种方法对纯化效果进行评估。首先，通过SDS电泳分析纯化前后的IgY样品。结果显示，纯化后的IgY在相对分子质量约为50kDa处出现单一的蛋白条带，与预期的IgY分子量相符。相比之下，未纯化样品中存在多个条带，表明纯化过程有效地去除了非特异性蛋白和杂质。

(2)其次，我们采用Westernblotting技术进一步验证纯化效果。将纯化后的IgY与鸡