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研究报告

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表达肠出血性大肠杆菌O157O-抗原重组减毒沙门菌的构建及其免疫效果评价

一、1.肠出血性大肠杆菌O157O-抗原重组减毒沙门菌构建

1.1重组菌株的筛选与鉴定

(1)在本研究中，我们通过构建肠出血性大肠杆菌O157O-抗原重组减毒沙门菌，首先采用PCR技术对目的基因进行扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。结果显示，目的基因片段大小约为1.5kb，与预期大小相符。随后，我们将扩增的基因片段克隆至表达载体pET-28a(+)中，构建重组表达质粒。通过转化大肠杆菌DH5α，获得阳性克隆，并进行测序验证，确保目的基因正确插入表达载体。

(2)为了筛选出具有良好表达效果的重组菌株，我们采用蓝白斑筛选法对转化子进行初步筛选。结果显示，在含有IPTG的培养基上，白色菌落表明重组菌株成功表达目的蛋白。进一步通过Westernblotting实验，以抗O157O-抗原单克隆抗体为一抗，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗，对重组菌株进行检测。结果显示，在预期分子量位置出现特异性条带，表明重组菌株成功表达了O157O-抗原蛋白。

(3)为了验证重组菌株的稳定性和安全性，我们对重组菌株进行了一系列的鉴定实验。首先，通过PCR检测重组菌株的质粒DNA，结果显示重组质粒在菌液中稳定存在。其次，通过基因测序验证重组菌株的基因序列，未发现插入突变或移码突变。此外，我们还对重组菌株的细胞毒性进行了检测，结果显示重组菌株对小鼠成纤维细胞无明显的细胞毒性。以上结果表明，我们构建的肠出血性大肠杆菌O157O-抗原重组减毒沙门菌具有良好的表达效果、稳定性和安全性。

1.2重组菌株的质粒提取与鉴定

(1)在本研究中，为了获取高质量的重组菌株质粒，我们采用了经典的小量碱裂解法进行质粒提取。首先，将含有重组质粒的大肠杆菌DH5α菌株接种于含有氨苄西林的LB培养基中，37℃培养过夜。次日，取适量菌液，按照操作步骤进行碱裂解。具体操作包括：将菌液加入等体积的碱裂解缓冲液，混匀后加入等体积的异丙醇，室温放置5分钟。随后，12,000g离心5分钟，弃上清液。将沉淀重新加入1ml的TE缓冲液，混匀后12,000g离心1分钟，弃上清液。最后，将沉淀溶解于50μl的TE缓冲液中，即为提取的质粒。

(2)质粒提取后，我们通过琼脂糖凝胶电泳对提取的质粒进行初步鉴定。将提取的质粒与DNA分子量标准在同一琼脂糖凝胶上电泳，90V电压下电泳30分钟。结果显示，提取的质粒在约2.5kb处出现清晰的目的条带，与预期大小相符。此外，我们还对质粒的纯度进行了检测，结果显示A260/A280比值约为1.8，表明质粒纯度较高，适合后续的实验操作。

(3)为了进一步验证质粒的完整性，我们对提取的质粒进行了PCR扩增。以质粒为模板，利用特异性引物对目的基因进行扩增。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示，目的基因片段大小约为1.5kb，与预期大小一致。此外，我们还对质粒的酶切鉴定进行了实验。将提取的质粒与限制性内切酶进行酶切，酶切产物在琼脂糖凝胶电泳上显示，酶切位点处出现预期大小的片段，进一步证实了质粒的完整性。

1.3重组菌株的基因表达分析

(1)为了分析重组菌株的基因表达情况，我们采用实时荧光定量PCR技术对O157O-抗原基因的表达水平进行检测。实验中，选取了未转化的DH5α菌株作为对照组，以及转化的重组菌株作为实验组。结果显示，在重组菌株中，O157O-抗原基因的表达水平较对照组提高了约50倍。这一结果与Westernblotting实验中观察到的O157O-抗原蛋白表达情况相一致，表明重组菌株能够有效地表达目的基因。

(2)为了进一步验证基因表达水平在不同生长阶段的差异，我们对重组菌株在不同生长阶段（对数生长期、稳定生长期和衰退期）的基因表达水平进行了检测。结果显示，在稳定生长期，O157O-抗原基因的表达水平最高，达到对照组的80倍。而在对数生长期和衰退期，基因表达水平分别下降到对照组的30倍和40倍。这表明，O157O-抗原基因的表达受到菌株生长阶段的影响。

(3)为了研究不同诱导剂对O157O-抗原基因表达的影响，我们分别将重组菌株在含IPTG和不含IPTG的培养基中培养，并检测基因表达水平。结果显示，在含IPTG的培养基中，O157O-抗原基因的表达水平显著提高，达到对照组的100倍。而在不含IPTG的培养基中，基因表达水平仅为对照组的10倍。这一结果表明，IPTG作为一种诱导剂，能够有效地提高O157O-抗原基因的表达水平。

二、2.重组减毒沙门菌的生物学特性研究

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