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食品接触材料中3种致病菌的多重荧光PCR检测

一、1.检测方法概述

1.1多重荧光PCR技术原理

多重荧光PCR技术是一种高灵敏度和高特异性的分子生物学检测方法，其原理基于聚合酶链反应（PCR）技术。在PCR过程中，利用特异性的引物识别并扩增目标DNA序列。多重荧光PCR技术通过在同一反应体系中同时扩增多个靶标基因，从而实现对多种微生物的快速检测。在多重荧光PCR反应中，通常采用不同的荧光染料或荧光标记的探针来识别和区分不同的靶标DNA序列。

(1)该技术利用了荧光标记的寡核苷酸探针与靶标DNA序列的结合特性。这些探针具有特异性高、信号强和稳定性好的特点。在PCR扩增过程中，探针与靶标DNA序列结合后，荧光信号会增强，从而实现多重检测。这种结合方式确保了检测的准确性，减少了假阳性和假阴性的出现。

(2)多重荧光PCR技术具有以下优点：首先，它可以同时检测多种病原体，提高了检测效率；其次，由于采用了荧光标记和自动化检测系统，减少了人为操作误差，提高了检测的可靠性；最后，多重荧光PCR技术具有高灵敏度和快速检测的特点，能够在早期发现病原体，为疾病的预防和控制提供了有力支持。

(3)在多重荧光PCR技术中，通常采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术。这种技术通过实时监测PCR反应过程中的荧光信号变化，实现对靶标DNA序列的定量分析。实时荧光定量PCR技术具有以下特点：实时监测、高灵敏度、高通量、可重复性高等。通过优化反应条件和选择合适的荧光染料或探针，可以实现对多种微生物的高效检测。

1.2检测目的和意义

(1)多重荧光PCR检测在食品安全领域具有重要的应用价值。其主要目的在于通过快速、准确地检测食品接触材料中的致病菌，保障公众健康。随着食品工业的快速发展，食品接触材料的使用日益广泛，而致病菌的污染风险也随之增加。通过实施多重荧光PCR检测，可以有效识别和监控食品接触材料中的潜在致病菌，降低食品安全风险。

(2)检测目的还包括提高食品安全监管水平。多重荧光PCR技术的高灵敏度和特异性使其成为食品安全检测的理想工具。通过该技术，监管部门可以及时发现食品接触材料中的致病菌污染，采取相应的控制措施，防止病原体传播。此外，多重荧光PCR检测还可用于评估食品接触材料的安全性，为食品接触材料的生产和使用提供科学依据。

(3)多重荧光PCR检测在疾病预防与控制方面具有重要意义。通过检测食品接触材料中的致病菌，可以追溯病原体的来源，为疾病防控提供线索。同时，该技术有助于提高疾病预防意识，促进公众对食品安全问题的关注。在突发公共卫生事件中，多重荧光PCR检测可迅速识别病原体，为疾病防控提供有力支持，降低疾病传播风险。

1.3检测流程概述

(1)多重荧光PCR检测流程的起始环节是样品的采集与保存。这一步骤要求严格遵循相关规范，以确保样品的完整性和代表性。样品采集通常涉及食品接触材料表面、内部或包装材料等不同部位。采集后，样品需立即进行适当的保存，以防止微生物的降解和污染。保存方法包括低温保存、冷冻保存或使用防腐剂等。

(2)样品处理与DNA提取是检测流程中的关键步骤。首先，对采集的样品进行预处理，如研磨、溶解等，以增加微生物释放率。随后，通过离心、过滤等物理方法分离微生物，并提取其DNA。DNA提取方法包括传统的化学提取法、柱式提取法和磁珠提取法等。提取的DNA质量直接影响后续PCR反应的效率和准确性。

(3)在完成DNA提取后，进入多重荧光PCR反应阶段。这一阶段主要包括以下步骤：①设计并合成特异性引物和探针；②配置PCR反应体系，包括模板DNA、引物、探针、dNTPs、DNA聚合酶等；③进行PCR扩增，包括预变性、变性、退火和延伸等步骤；④通过荧光检测系统实时监测PCR反应过程中的荧光信号变化，实现对目标DNA序列的定量分析。最后，根据荧光信号强度和扩增曲线，对检测结果进行判断和报告。整个检测流程要求严格控制实验条件，确保结果的准确性和可靠性。

二、2.致病菌种类介绍

2.1肠致病性大肠杆菌

(1)肠致病性大肠杆菌（EnteropathogenicE.coli，EPEC）是一类能够引起人类和动物肠道感染的病原体。这种细菌主要通过污染的食品和水传播，是人类和动物腹泻的重要病因之一。EPEC具有特定的致病基因，如eae（肠上皮附着因子）基因，它能够帮助细菌在肠道上皮细胞上附着并侵入细胞。

(2)EPEC的感染过程通常包括几个阶段。首先，细菌通过口摄入被污染的食物或水进入宿主体内。接着，细菌在肠道内定植并开始繁殖。EPEC通过其致病因子eae与宿主肠道上皮细胞表面的特定受体结合，从而在细胞表面形成附着斑。随后，细菌利用其致病性肠毒素和内毒素等毒力因子引起肠道炎症和腹泻等症状。

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