信前胡烟草花叶病毒lncRNA测序鉴定、原核蛋白表达及其序列分析.docx

研究报告

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信前胡烟草花叶病毒lncRNA测序鉴定、原核蛋白表达及其序列分析

一、信前胡烟草花叶病毒lncRNA测序鉴定

1.lncRNA测序实验设计

(1)在设计信前胡烟草花叶病毒lncRNA测序实验时，我们首先确定了测序样本的来源和数量。本研究选取了感染信前胡烟草花叶病毒的烟草叶片作为实验样本，共收集了30个样本。为了确保数据的准确性和可靠性，每个样本进行了3次重复测序。在样本处理方面，我们采用了RNA提取试剂盒进行总RNA的提取，并通过RNA质检仪对提取的RNA进行浓度和纯度检测。结果显示，所有样本的RNA浓度均大于1.0μg/μL，A260/A280比值在1.8-2.0之间，符合测序要求。

(2)为了提高lncRNA的检测灵敏度，我们选择了IlluminaHiSeq2500平台进行测序。根据实验设计，每个样本的测序深度设定为100Mreads，总共需要300Mreads。在测序文库构建过程中，我们采用了RNA-seq文库构建试剂盒，并通过Agilent2100生物分析仪对文库质量进行检测。结果显示，所有样本的文库质量均达到测序要求，文库浓度在200-300ng/μL之间，文库片段长度分布符合预期。

(3)在数据分析阶段，我们首先对测序数据进行质量控制，包括去除低质量序列、接头序列和重复序列。接着，利用STAR软件将测序reads映射到信前胡烟草花叶病毒参考基因组上，并对映射结果进行统计和分析。通过筛选出长度大于200nt、无内含子、表达量大于1的表达序列，我们共鉴定出50个lncRNA候选基因。为进一步验证这些lncRNA候选基因的准确性，我们选取了其中10个基因进行RT-qPCR验证，结果显示，9个基因的表达水平与测序结果一致，验证了测序结果的可靠性。

2.测序数据质量控制

(1)测序数据质量控制是保证后续分析结果准确性的关键步骤。在本研究中，我们首先对IlluminaHiSeq2500平台生成的原始测序数据进行了一系列严格的质量控制。这包括去除低质量序列，这些序列通常具有较高的错误率，可能影响后续分析。我们使用FastQC软件对原始数据进行质量评估，识别出错误率高的区域，并从每条reads中去除这些区域。此外，我们还去除了含有接头序列的reads，因为这些序列可能源自测序过程中的添加，而不是真实的基因组序列。通过这些预处理步骤，我们确保了后续分析的测序数据具有较高的质量。

(2)在质量控制过程中，我们还对测序数据进行了碱基质量得分和序列一致性的分析。利用FastQC软件，我们检查了测序read的碱基质量得分分布，确保所有的read都有足够的高质量碱基（通常要求Q30碱基比例大于90%）。同时，我们还分析了序列的一致性，即同一reads在不同位置的碱基一致性。如果发现异常高的一致性，可能表明测序错误或者存在PCR重复。通过这些分析，我们能够识别并排除那些可能由于测序错误或PCR扩增引起的偏差。

(3)为了进一步验证测序数据的质量，我们采用了比对软件STAR对测序数据进行了基因组的比对。这一步骤不仅帮助我们识别出真实的转录本，而且还能揭示可能的基因组变异和转录错误。在比对过程中，我们设置了严格的参数，以确保只有高质量的read才会被比对到基因组上。此外，我们还对比对结果进行了统计，包括比对率、唯一比对率和覆盖深度等指标。这些指标有助于我们了解数据的完整性和均匀性。通过对比对结果的详细分析，我们确保了后续lncRNA鉴定和分析的准确性。

3.lncRNA筛选标准制定

(1)在制定lncRNA筛选标准时，我们综合考虑了多个因素，包括lncRNA的长度、表达量、序列保守性以及与病毒基因组的关系。首先，我们设定了lncRNA的最小长度标准，通常lncRNA的长度应大于200个核苷酸。这一标准是基于已有研究中lncRNA的普遍长度，并且通过分析信前胡烟草花叶病毒基因组，我们确定了其转录本的最小长度阈值。在初步筛选过程中，我们共获得了200个候选lncRNA，其中超过80%的候选lncRNA长度符合这一标准。

(2)其次，表达量是筛选lncRNA的重要指标之一。我们通过测序数据计算了每个候选lncRNA的表达量，并设定了阈值。根据实验数据，我们选取了表达量大于1的lncRNA作为候选，这一标准是基于信前胡烟草花叶病毒感染样本中lncRNA的表达水平。在初步筛选的200个候选lncRNA中，有120个满足表达量标准。进一步分析这些lncRNA在病毒感染和未感染样本中的表达差异，我们发现其中40个lncRNA在感染样本中的表达量显著高于未感染样本。

(3)为了确保筛选出的lncRNA与病毒基因组有直接关系，我们对比了候选lncRNA的序列与病毒基因组的同源