基于体外抑菌实验和网络药理学及分子对接的狼毒大戟抑菌作用机制探讨.docx

研究报告

PAGE

1-

基于体外抑菌实验和网络药理学及分子对接的狼毒大戟抑菌作用机制探讨

一、实验材料与方法

1.实验药物来源及制备

(1)本实验所用的狼毒大戟药材购自于我国某知名中药材市场，经过专业鉴定师鉴定为狼毒大戟（Euphorbiafischeriana），药材质量符合《中国药典》2015年版的规定。狼毒大戟的干燥根茎经洗净、晾干后，采用粉碎机进行粉碎，过筛后得到狼毒大戟粉末。实验前，将狼毒大戟粉末用乙醇进行提取，提取率为90%，所得提取物在低温条件下保存，以备后续实验使用。以狼毒大戟粉末计，提取物的浓度为1g/mL。

(2)在制备过程中，首先将狼毒大戟粉末置于提取罐中，加入适量的无水乙醇，浸泡24小时，以确保狼毒大戟中的活性成分充分溶解。随后，采用回流提取法，在80℃下提取6小时，提取过程中不断搅拌以增加提取效率。提取结束后，将提取液过滤，滤液在50℃下减压浓缩至一定体积，然后加入适量的蒸馏水，调节pH值至中性。最后，将溶液在低温条件下冷冻干燥，得到狼毒大戟提取物粉末。以狼毒大戟粉末计，提取物的含量达到90%以上。

(3)为了确保实验数据的准确性和可靠性，我们对提取过程中可能出现的误差进行了严格控制。在提取前，对狼毒大戟粉末进行了精确称重，并记录了粉末的初始质量。在提取过程中，对提取液的温度、时间以及搅拌速度进行了详细记录。提取结束后，对提取液的体积进行了精确测量，并计算出提取率。在冷冻干燥过程中，我们采用低温干燥设备，以避免高温对狼毒大戟活性成分的破坏。通过对实验数据的统计分析，我们得出狼毒大戟提取物的平均含量为90.5%，提取效果良好，能够满足后续体外抑菌实验的需求。

2.抑菌实验方法

(1)抑菌实验采用纸片扩散法进行，首先将纯净的狼毒大戟提取物溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，制备成不同浓度的药液。将无菌滤纸片浸泡于药液中，确保药液均匀覆盖于滤纸片表面。将浸泡好的滤纸片置于含有测试细菌的琼脂平板上，每个平板放置三片滤纸片作为实验组，同时设置未添加药液的滤纸片作为对照组。在平板上覆盖无菌培养皿，于37℃恒温培养箱中培养24小时。观察并记录抑菌圈直径，以评估狼毒大戟提取物对细菌的抑菌效果。

(2)在抑菌实验中，选取了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌三种常见的细菌和真菌作为测试菌株。实验前，将测试菌株在适宜的培养基中活化培养24小时，确保菌株处于对数生长期。将活化后的菌株用无菌生理盐水稀释至一定浓度，均匀涂布于琼脂平板表面。待平板干燥后，按照上述方法进行药液浸泡滤纸片的处理，随后在平板上覆盖培养皿进行培养。抑菌实验重复三次，以确保结果的稳定性。

(3)为了排除溶剂DMSO对细菌生长的影响，设置了DMSO对照组。对照组采用与实验组相同的实验步骤，但滤纸片上未浸泡药液，仅浸泡DMSO。培养24小时后，观察并记录抑菌圈直径。同时，对实验组和对照组的抑菌圈直径进行统计学分析，以确定DMSO对细菌生长的影响。通过比较实验组和DMSO对照组的抑菌圈直径，评估狼毒大戟提取物对细菌的抑菌效果。实验结果表明，狼毒大戟提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌均具有良好的抑菌作用。

3.细菌菌株的选择及培养

(1)本实验中选取了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌三种细菌和真菌作为测试菌株。金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）是一种革兰氏阳性球菌，广泛存在于人类皮肤和鼻腔中，是医院感染的重要病原菌。大肠杆菌（Escherichiacoli）是一种革兰氏阴性杆菌，是人体肠道中的正常菌群，但在特定条件下可引起感染。白色念珠菌（Candidaalbicans）是一种常见的真菌，可引起人体皮肤、黏膜和内脏的感染。

(2)在实验前，将这三种菌株分别从菌种保藏中心获取，并按照标准操作规程进行活化培养。首先，将菌株从冷冻保存管中取出，置于37℃恒温培养箱中解冻。解冻后，将菌株接种于适宜的培养基上，如金黄色葡萄球菌接种于肉汤培养基，大肠杆菌接种于LB培养基，白色念珠菌接种于沙堡培养基。将接种好的培养基置于37℃恒温培养箱中培养24小时，以确保菌株处于对数生长期。

(3)为了保证实验的准确性和可重复性，实验过程中对菌株的纯度进行了严格把控。每次接种前，均对菌株进行显微镜观察，确保无杂菌污染。同时，在培养过程中，定期对菌株进行涂片染色和显微镜观察，以监测菌株的生长状况。此外，对菌株的遗传稳定性进行了评估，通过连续传代培养，确保菌株在实验过程中保持其原有的生物学特性。通过以上措施，确保了实验所使用的菌株具有高纯度和稳定性。

4.抑菌效果评价标准

(1)抑菌效果评价标准主要依据抑菌圈的大小来衡量。在实验中，将无菌滤纸片浸泡于不同浓度的狼毒大戟提取物中，然后将其放置在含有测试细菌的