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棉花(Gossypiumhirsutum)WRKY基因的分离与鉴定

一、研究背景

棉花作为全球重要的经济作物，其生长发育过程常常面临着多种生物和非生物胁迫，这些胁迫会严重影响棉花的产量和品质。WRKY基因家族是植物中一类重要的转录因子家族，在植物的生长发育、胁迫响应等多种生理过程中发挥着关键的调控作用。WRKY蛋白通过与靶基因启动子中的W-box（TTGACC/T序列）结合，从而激活或抑制靶基因的表达，进而参与植物对病原菌侵染、干旱、盐碱等逆境的应对。

鉴于WRKY基因在植物抗逆等生理过程中的重要性，对棉花（Gossypiumhirsutum）中WRKY基因进行分离与鉴定，深入探究其功能，对于揭示棉花抗逆机制、培育抗逆性强的棉花品种具有重要的理论意义和实践价值。目前，虽然在拟南芥、水稻等模式植物中对WRKY基因的研究已较为深入，但在棉花中相关研究仍有待进一步拓展。

二、棉花WRKY基因的分离

（一）材料准备

选取处于适宜生长阶段且无病虫害的棉花（Gossypiumhirsutum）植株的叶片、根等组织作为实验材料。采集后的材料需迅速用液氮冷冻处理，以防止RNA降解，随后将其保存于-80℃超低温冰箱中备用。

（二）总RNA的提取与cDNA合成

采用Trizol法提取棉花组织的总RNA。具体操作如下：将冷冻的棉花组织在液氮中研磨成粉末状，加入适量的Trizol试剂，充分混匀后室温放置5分钟；然后加入氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置2-3分钟后，4℃下12000rpm离心15分钟；取上层水相，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置10分钟后，4℃下12000rpm离心10分钟，弃去上清液；用75%的乙醇洗涤沉淀，4℃下7500rpm离心5分钟，弃去上清液，室温晾干沉淀后，加入适量的RNase-free水溶解RNA。

提取的总RNA需进行纯度和完整性检测。通过紫外分光光度计测定OD260/OD280比值，若比值在1.8-2.0之间，说明RNA纯度较高；采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，若28SrRNA和18SrRNA条带清晰，且28SrRNA的亮度约为18SrRNA的2倍，表明RNA完整性较好。

以提取的总RNA为模板，按照反转录试剂盒的说明书进行cDNA第一链的合成。反应体系包括总RNA、反转录引物、dNTPs、反转录酶等，在适宜的温度条件下进行反应，合成的cDNA可用于后续的PCR扩增实验。

（三）引物设计与PCR扩增

根据已公布的其他植物WRKY基因的保守序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。引物设计需遵循以下原则：引物长度一般为18-25bp，GC含量在40%-60%之间，避免引物自身形成二级结构以及引物之间形成互补配对。

以合成的cDNA为模板，进行PCR扩增反应。反应体系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、缓冲液等。PCR反应程序设置如下：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，退火温度根据引物的Tm值设定，退火30秒，72℃延伸1分钟，进行35个循环；最后72℃延伸10分钟。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，若出现与预期大小相符的特异性条带，采用胶回收试剂盒回收目的片段。

（四）目的基因的克隆与测序

将回收的目的片段与pMD19-T载体连接，连接反应体系包括目的片段、pMD19-T载体、T4DNA连接酶、缓冲液等，在16℃条件下连接过夜。

将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，具体操作如下：将感受态细胞从-80℃冰箱中取出，冰上解冻；加入适量的连接产物，轻轻混匀，冰浴30分钟；然后42℃热激90秒，迅速冰浴2分钟；加入适量的LB液体培养基，37℃振荡培养1小时；将培养物涂布于含有氨苄青霉素、IPTG和X-Gal的LB固体培养基上，37℃培养过夜。

挑取白色菌落进行PCR鉴定，将鉴定为阳性的菌落接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒。对提取的质粒进行酶切鉴定，若酶切产物出现目的片段和载体片段，表明目的基因已成功克隆到载体中。将阳性克隆送测序公司进行测序。

三、棉花WRKY基因的鉴定

（一）序列分析

对测序得到的基因序列进行分析，利用NCBI中的BLAST程序与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，确定该基因是否为WRKY基因。同时，对基因序列进行开放阅读框（ORF）预测，确定其编码的氨基酸序列。

（二）生物