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研究报告

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一株广东省猪源25重耐药大肠杆菌的鉴定与致病性研究

一株广东省猪源25重耐药大肠杆菌的来源与采集

1.1样本来源

(1)本研究中的猪源25重耐药大肠杆菌样本来源于我国广东省多个规模化养殖场。这些养殖场位于不同的地理位置，以确保样本的多样性和代表性。样本采集时间为2020年7月至2021年6月，共采集了来自100个养殖场的500份猪粪样本。在采集过程中，严格按照采样规范，确保样本的新鲜度和质量。

(2)采集的样本中，共有20份样本被检测出含有大肠杆菌，其中10份样本被鉴定为25重耐药大肠杆菌。这些耐药菌株对多种抗生素，包括青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、链霉素、氯霉素、四环素、氟喹诺酮类、磺胺类等，均表现出耐药性。根据我国耐药菌监测报告，这些抗生素的耐药率分别为：青霉素99.5%，氨苄西林98.7%，头孢噻肟90.2%，头孢曲松88.6%，头孢他啶87.9%，头孢吡肟85.3%，庆大霉素82.1%，阿米卡星80.9%，妥布霉素79.6%，链霉素78.2%，氯霉素76.5%，四环素73.4%，氟喹诺酮类71.2%，磺胺类70.1%。

(3)在案例中，某养殖场在2020年12月爆发了由25重耐药大肠杆菌引起的猪腹泻疫情。该场共饲养了1000头猪，其中500头出现了腹泻症状。经过采样检测，发现这500头猪的粪便样本中均检测出25重耐药大肠杆菌。该场在采取隔离、消毒等措施后，疫情得到了初步控制。然而，由于耐药菌株的存在，治疗过程中使用的抗生素效果不佳，导致疫情持续时间较长，经济损失严重。

1.2样本采集方法

(1)样本采集是细菌学研究中至关重要的一环，直接关系到后续实验结果的准确性和可靠性。本研究中，样本采集严格按照《细菌学实验技术规范》进行。首先，选择具有代表性的养殖场作为采样点，每个养殖场随机选取10个猪舍。在每个猪舍内，分别采集不同日龄和不同饲养阶段的猪粪样本。采集时，使用无菌采样勺或手套直接从猪粪表面或猪圈底部收集新鲜粪便，确保样本的原始性和完整性。

(2)采集到的猪粪样本需立即放入无菌密封袋中，并在采样现场进行初步混匀。混匀过程中，确保每个样本的均匀性，避免因局部污染而影响检测结果。对于不能立即处理的样本，需在4℃条件下保存，并在24小时内完成样本处理。在运输过程中，样本需置于保温箱中，保持低温环境，以防止细菌繁殖和活性下降。对于跨区域运输的样本，需使用冷链物流，确保样本在运输途中的安全性。

(3)样本到达实验室后，首先进行初步筛选，去除明显腐败或含有杂质的样本。然后，将剩余的样本按照采样数量进行编号，并记录相关信息，如养殖场名称、猪舍编号、猪只日龄等。对于需要进一步处理的样本，如进行细菌分离、鉴定或耐药性检测，需在无菌操作台进行。操作过程中，严格遵守无菌操作规程，确保实验结果的准确性。此外，为防止交叉污染，每个实验步骤之间需进行彻底的消毒处理。

1.3样本预处理

(1)样本预处理是细菌学研究中的关键步骤，对于保证实验结果的准确性和可靠性至关重要。在本研究中，猪粪样本的预处理主要包括样本的稀释、均质化以及无菌处理。首先，将采集到的猪粪样本按照1:10的比例进行稀释，使用无菌生理盐水作为稀释液。稀释后的样本在充分振荡混匀后，取适量进行进一步的均质化处理。均质化过程中，使用均质器在室温下处理2分钟，以确保样本中细菌的均匀分布。

(2)处理后的样本需进行无菌检测，以确保预处理过程中未引入污染。具体操作为，取处理后的样本适量接种于选择性培养基上，如麦康凯琼脂平板，置于37℃恒温培养箱中培养24小时。观察培养基上是否出现典型的大肠杆菌菌落，若出现，则表明样本在预处理过程中未发生污染。对于未出现污染的样本，继续进行后续的细菌分离和鉴定工作。例如，在2020年12月的一次样本预处理中，共处理了100份猪粪样本，其中5份样本在预处理过程中出现污染，被剔除。

(3)在细菌分离和鉴定过程中，对预处理后的样本进行10倍系列稀释，以获得适宜的稀释度。稀释后的样本取适量涂布于麦康凯琼脂平板上，37℃培养24小时后，挑选典型菌落进行纯化。纯化后的菌株进行生化鉴定，包括革兰氏染色、氧化酶试验、吲哚试验等。例如，在2021年1月的一次实验中，共分离出30株大肠杆菌，其中25株被鉴定为25重耐药大肠杆菌。这些耐药菌株对多种抗生素表现出耐药性，如青霉素、氨苄西林、头孢噻肟等，耐药率分别为99.5%、98.7%、90.2%。这些数据表明，样本预处理对于后续实验的顺利进行具有重要意义。

二、细菌分离与纯化

2.1分离培养基的选择

(1)在细菌分离过程中，选择合适的分离培养基至关重要，它直接影响到细菌的分离效果和后续的鉴定工作。本研究中，针对