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研究报告

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蛋清中溶菌酶的提取及其体外抑菌试验

一、实验目的

1.1了解溶菌酶的性质和功能

(1)溶菌酶是一种广泛存在于动物蛋清中的天然酶，属于糖蛋白类，具有高度的水解活性。它能够特异性地识别并水解细菌细胞壁中的肽聚糖，从而破坏细菌细胞壁的结构，导致细菌细胞破裂死亡。据研究表明，溶菌酶的最适pH值为6.5-7.5，最适温度为37-45℃，在此条件下，溶菌酶的活性最高。例如，在人体中，溶菌酶的活性在体温下能够达到最大值，这对于人体抵御病原微生物的入侵具有重要意义。

(2)溶菌酶在医学、食品工业和农业等领域具有广泛的应用。在医学领域，溶菌酶被用于治疗呼吸道感染、伤口感染等疾病。据临床试验表明，溶菌酶能够有效抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等细菌的生长，对于提高患者的康复率具有显著效果。在食品工业中，溶菌酶被用作防腐剂，能够有效防止食品变质，延长食品的保质期。例如，在奶酪生产过程中，添加溶菌酶可以抑制乳酸菌的生长，从而防止奶酪腐败。

(3)在农业领域，溶菌酶被用作生物农药，具有环保、高效、低残留等特点。溶菌酶能够抑制病原菌的生长，减少农药的使用，降低环境污染。例如，在水稻种植过程中，使用溶菌酶生物农药可以有效防治稻瘟病、纹枯病等病害，提高水稻的产量和品质。此外，溶菌酶还被用于动物饲料添加剂，能够提高动物的生长速度和免疫力，降低动物疾病的发生率。

1.2掌握蛋清中溶菌酶的提取方法

(1)蛋清中溶菌酶的提取方法主要包括物理法、化学法和酶法。物理法主要包括离心分离和超滤技术，通过物理手段将溶菌酶从蛋清中分离出来。离心分离利用溶菌酶与其他蛋白质在密度上的差异，通过高速旋转使溶菌酶沉淀。例如，在实验室条件下，采用4℃、10000rpm的离心速度进行离心处理，大约需要30分钟，可以得到较为纯净的溶菌酶沉淀。超滤技术则是利用溶菌酶分子量的大小差异，通过半透膜进行分离，这种方法可以进一步纯化溶菌酶，去除其他杂质。

(2)化学法提取溶菌酶主要依赖于酸碱处理和盐析技术。酸碱处理是通过调节pH值，使溶菌酶从蛋白质复合物中释放出来。例如，将蛋清溶液pH值调至4.5，可以使溶菌酶的溶解度降低，从而使其沉淀。盐析技术则是通过向蛋清溶液中加入高浓度的盐溶液，使溶菌酶的溶解度下降，进而沉淀。在实际操作中，通常使用氯化钠或硫酸铵作为盐析剂。例如，加入硫酸铵至终浓度为0.5M，可以在室温下静置一段时间，让溶菌酶沉淀。

(3)酶法提取溶菌酶是利用其他酶的作用，使溶菌酶从蛋清中释放出来。常用的酶包括蛋白酶和肽酶。蛋白酶可以特异性地水解蛋清中的蛋白质，使溶菌酶从蛋白质复合物中分离出来。肽酶则能够水解肽键，进一步分解蛋白质，从而提高溶菌酶的提取率。例如，使用木瓜蛋白酶处理蛋清，可以在一定温度和时间条件下，有效地分解蛋清中的蛋白质，释放出溶菌酶。在实际操作中，需要根据实验目的和条件选择合适的酶和反应条件，以确保溶菌酶的活性不受影响。

1.3学习溶菌酶的体外抑菌试验方法

(1)溶菌酶的体外抑菌试验是研究溶菌酶抗菌活性的重要方法。该试验通常采用纸片扩散法、微量稀释法和浊度法等。纸片扩散法是最常用的方法之一，其原理是将含有已知浓度的溶菌酶的纸片放置在含有细菌的培养基上，溶菌酶通过扩散作用到达细菌周围，若溶菌酶具有抗菌活性，则会在纸片周围形成抑菌圈。例如，在纸片扩散法中，常用浓度为10mg/mL的溶菌酶纸片，通过观察抑菌圈的大小来评估溶菌酶的抗菌活性。

(2)微量稀释法是一种定量测定溶菌酶抗菌活性的方法。该方法通过将溶菌酶溶液稀释至不同的浓度，然后与细菌混合培养，观察细菌的生长情况。根据细菌的生长抑制情况，可以计算出溶菌酶的最小抑菌浓度（MIC）。例如，在微量稀释法中，通常将溶菌酶溶液稀释至10^-1至10^-7g/mL，通过培养24小时后，观察细菌的生长情况，确定MIC。

(3)浊度法是另一种常用的体外抑菌试验方法，其原理是利用溶菌酶对细菌细胞壁的破坏作用，使细菌悬浮液的浊度降低。通过测定浊度的变化，可以评估溶菌酶的抗菌活性。例如，在浊度法中，将一定浓度的溶菌酶溶液与细菌混合，在特定波长下测定混合液的浊度，随着溶菌酶作用时间的延长，浊度逐渐降低，从而反映溶菌酶的抗菌活性。浊度法具有操作简便、快速等优点，适用于大规模的抗菌活性检测。在实际应用中，可以根据实验目的和条件选择合适的体外抑菌试验方法，以确保实验结果的准确性和可靠性。

二、实验原理

2.1溶菌酶的化学性质

(1)溶菌酶的化学性质主要体现在其蛋白质结构和活性中心上。溶菌酶是一种糖蛋白，由129个氨基酸残基组成，分子量为14kDa。其蛋白质结构包括一个由两个结构域组成的β-折叠结构，其中活性中心位于一个由两个氨基酸残基组成的疏水口袋内。该活性中心对于溶菌酶的水解活性至关重要。研