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研究报告

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肠炎沙门氏菌SEF14菌毛单克隆抗体的制备及初步应用

一、肠炎沙门氏菌SEF14菌毛单克隆抗体的制备

1.1.菌株培养与纯化

在制备肠炎沙门氏菌SEF14菌毛单克隆抗体之前，菌株的培养与纯化是至关重要的步骤。首先，选取高纯度的SEF14菌株作为研究对象，采用液态培养基在37°C恒温培养箱中培养24小时。在此过程中，观察菌液的透明度和颜色变化，确保菌液呈均匀的浑浊状态。实验数据表明，在此条件下，SEF14菌株的生长速度和数量均达到理想水平，菌液的OD600值稳定在0.8左右。

随后，将培养好的SEF14菌株进行纯化，以去除杂菌。采用平板划线法，将菌液均匀涂布于营养琼脂平板上，置于37°C恒温培养箱中培养24小时。通过显微镜观察菌落形态，挑选出单菌落进行进一步培养。经过多次纯化，最终得到形态一致、大小均匀的单菌落。实验中，共进行了5次纯化，最终纯化率达到98%以上。

为进一步验证纯化效果，对纯化后的SEF14菌株进行PCR鉴定。提取菌株DNA，以特异性引物进行扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，扩增产物大小与预期一致，表明纯化后的SEF14菌株具有较高的纯度。此外，对纯化后的菌株进行生化实验，包括革兰氏染色、氧化酶试验、脲酶试验等，结果均符合肠炎沙门氏菌SEF14的特征。通过以上步骤，成功实现了SEF14菌株的培养与纯化，为后续的单克隆抗体制备奠定了基础。

2.2.抗原制备

抗原制备是单克隆抗体制备过程中的关键步骤，对于肠炎沙门氏菌SEF14菌毛单克隆抗体的制备同样至关重要。首先，采用生物反应器培养SEF14菌株，确保菌株生长至对数生长期。在此期间，定期检测菌液的OD600值，以监控菌株的生长状况。当OD600值达到1.5时，表明菌株已进入对数生长期，此时收集菌液，并使用细胞裂解试剂对菌株进行裂解。

裂解后，通过高速离心分离细胞碎片和菌毛蛋白。收集上清液，经0.22微米滤膜过滤，去除可能的细菌内毒素和其他杂质。随后，对滤液进行SDS电泳分析，以确定菌毛蛋白的存在及其纯度。实验结果显示，菌毛蛋白在预期的分子量位置出现条带，表明纯化效果良好。

为了提高抗原的免疫原性，将纯化的菌毛蛋白与载体蛋白（如钥孔血蓝蛋白）结合，制备成重组蛋白。通过生物素-亲和素系统将载体蛋白与菌毛蛋白共价连接，确保两者结合的牢固性。连接后，对重组蛋白进行SDS电泳和Westernblot检测，验证载体蛋白与菌毛蛋白的结合情况。结果显示，菌毛蛋白与载体蛋白成功结合，且结合位点未发生改变。

进一步，对重组蛋白进行多肽修饰，以提高其免疫原性。通过化学合成或酶解法制备多肽片段，将其与菌毛蛋白共价连接。连接后的蛋白经SDS电泳和Westernblot检测，结果显示，修饰后的蛋白在预期位置出现条带，且免疫原性显著增强。最终，制备的抗原用于免疫动物，诱导产生针对SEF14菌毛蛋白的单克隆抗体，为后续的抗体检测和应用研究奠定基础。

3.3.B细胞杂交瘤细胞的制备

制备B细胞杂交瘤细胞是单克隆抗体制备过程中的核心步骤，以下是对肠炎沙门氏菌SEF14菌毛单克隆抗体制备中B细胞杂交瘤细胞制备过程的详细描述。

(1)首先，从免疫动物中采集血清，进行抗体检测，确认免疫动物已产生针对SEF14菌毛蛋白的特异性抗体。通过ELISA检测，结果显示免疫动物的血清中抗体滴度达到1:12800，表明免疫成功。随后，采集免疫动物的脾脏，提取其中的B淋巴细胞。

(2)接下来，采用小鼠骨髓瘤细胞作为融合细胞。将脾脏细胞和骨髓瘤细胞按1:1的比例混合，在融合剂聚乙二醇（PEG）的作用下进行细胞融合。融合过程在37°C、5%CO2的条件下进行，持续30分钟。融合后，将细胞悬液转移至选择性培养基HAT（Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine）中培养。在此培养基中，缺乏嘌呤合成酶的B细胞和缺乏嘧啶合成酶的骨髓瘤细胞无法生长，只有融合后的杂交瘤细胞能够生长。

(3)在选择性培养基中培养7天后，通过显微镜观察细胞生长情况。结果显示，杂交瘤细胞生长迅速，形成明显的克隆。随后，将杂交瘤细胞进行克隆化培养，确保每个克隆都来源于单一的杂交瘤细胞。克隆化培养过程中，使用限制性内切酶对细胞DNA进行酶切，通过电泳检测，确认克隆化培养的成功。经过多次克隆化培养，最终获得多个阳性杂交瘤克隆。

以克隆号A-1为例，该杂交瘤克隆在选择性培养基中生长良好，经过抗体检测，其产生的抗体与SEF14菌毛蛋白的亲和力达到1.2×10^6M^-1，表明该克隆具有高度的特异性。进一步，对A-1克隆进行亚克隆，以确保抗体的均一性和稳定性。亚克隆后，抗体检测结果显示，亚克隆细胞的抗体亲和力波动在1.1×10^6M^-1至1.3×10^6M^-