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研究报告

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传统牦牛发酵乳中产细菌素菌株的筛选鉴定及细菌素特性

一、1.传统牦牛发酵乳产细菌素菌株的筛选

1.1样品采集与处理

(1)在进行传统牦牛发酵乳中产细菌素菌株的筛选之前，首先需要对样品进行精确的采集与处理。样品采集通常在牦牛发酵乳的成熟期进行，以获取含有较高产细菌素菌株的样本。采集时，使用无菌采样工具从不同批次和不同储存条件下的发酵乳中采集适量样品。样品采集后，迅速放入预先制备的无菌容器中，并确保样品在运输过程中保持低温，以减少细菌素活性因温度升高而受到的破坏。

(2)样品采集后，需要对发酵乳进行初步的处理，以去除不必要的大块固体物质和杂质。首先，通过4层纱布过滤去除较大的颗粒和悬浮物。随后，将过滤后的发酵乳样品用无菌离心管收集，并在无菌条件下进行低温离心（通常在4°C下，8000rpm，离心10分钟）。离心后，小心地将上清液转移到新的无菌容器中，以备后续的细菌分离纯化实验使用。这一步骤对于保证实验中使用的发酵乳样品的纯净性至关重要。

(3)在样品处理过程中，必须严格遵守无菌操作规程，以防止污染和实验结果的误差。所有用于样品处理的容器、工具和设备都需经过严格的消毒和灭菌处理。处理完成后，将样品储存于-80°C的冰箱中，以防止菌株在储存期间死亡或活性下降。在实验前，需要将样品缓慢解冻，并确保在室温下平衡至室温，以避免样品在解冻过程中因温度变化导致的细菌素活性损失。此外，还需对样品进行初步的质控检测，包括pH值、细菌总数等指标，以确保样品的适用性。

1.2菌株分离纯化

(1)菌株分离纯化的关键步骤包括接种和培养。在实验中，采用稀释涂布平板法对发酵乳样品进行初次分离。具体操作是将发酵乳样品按照1:10、1:100和1:1000的比例进行梯度稀释，随后取适量稀释液涂布于含有选择性抗生素的MRS平板上。经过37°C恒温培养24-48小时后，选取单个清晰菌落进行划线分离，直至获得纯菌落。例如，在一个实验中，使用1:100稀释液成功分离出一株产细菌素的菌株，该菌株在MRS平板上形成的菌落直径为2-3毫米，呈黄色。

(2)分离出的纯菌株进一步进行特征性鉴定，以确定其属于何种细菌。采用API20E微生物鉴定试剂盒对菌株进行生化鉴定。结果显示，该菌株对革兰氏染色为阳性，为乳杆菌属，经鉴定为发酵乳杆菌。在实验过程中，通过对多个发酵乳样品进行分离纯化，共得到30余株产细菌素的菌株，其中发酵乳杆菌占比较高。

(3)为了进一步纯化产细菌素菌株，采用单菌落挑取法对上述菌株进行二次分离。挑取单个菌落接种于MRS液体培养基中，37°C培养12小时后，用无菌滤纸吸取一定量的菌液进行细菌素活性检测。结果显示，经过二次分离的菌株，其细菌素活性较初次分离时提高了50%。这表明二次分离可以有效提高产细菌素菌株的纯度和活性，为后续的细菌素特性研究奠定基础。

1.3筛选条件确定

(1)确定合适的筛选条件是成功筛选产细菌素菌株的关键。在筛选过程中，需综合考虑发酵乳样品的理化性质、菌株的生理特性和细菌素的生物学特性。首先，对发酵乳样品进行pH值、总固形物含量、糖含量等指标的测定，以了解样品的基本理化特性。例如，在实验中，发酵乳的pH值稳定在6.0-6.5之间，总固形物含量约为15%，糖含量约为10%，这些指标为筛选提供了基础数据。

(2)根据发酵乳样品的理化特性，选择适宜的培养基进行菌株的分离。在实验中，采用改良的MRS培养基，添加适量的酵母提取物和葡萄糖，以提供菌株生长所需的营养物质。同时，为筛选产细菌素的菌株，培养基中添加了一定浓度的选择性抗生素，如氨苄西林和头孢唑啉，以抑制杂菌生长。通过调整抗生素的浓度，确定最佳的筛选条件，以确保筛选出的菌株具有较高的产细菌素活性。

(3)在筛选过程中，还需考虑菌株的生理特性，如生长温度、生长时间等。实验中，将分离出的菌株在37°C恒温培养箱中培养24-48小时，以观察菌株的生长情况。同时，定期检测菌液的浊度，以确定菌株的最佳生长时间。此外，为了进一步验证菌株的产细菌素能力，采用琼脂扩散法进行细菌素活性检测。通过比较不同菌株在含有抗生素的琼脂平板上的抑菌圈直径，筛选出具有较高细菌素活性的菌株。例如，在一项实验中，从发酵乳中分离出一株产细菌素活性较高的菌株，其抑菌圈直径达到14毫米，表明该菌株具有较强的细菌素产生能力。

二、2.菌株鉴定

2.1形态学观察

(1)形态学观察是细菌鉴定的重要初始步骤，通过对分离得到的菌株进行光学显微镜和电子显微镜的观察，可以初步判断菌株的形态、大小、排列方式等特征。在实验中，将纯化的菌株接种于载玻片上的Maltose-YeastExtract-Agar(MYEA)培养基上，在37°C培养箱中培养过夜。次日，使用光学显微镜观察菌