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研究报告

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II型鲨鱼源单域抗体EF73在大肠杆菌中的稳定表达

一、实验目的

1.探索II型鲨鱼源单域抗体EF73在大肠杆菌中的表达潜力

(1)随着生物技术的不断发展，单域抗体因其独特的结构特性和多功能性在疾病诊断和治疗领域展现出巨大的潜力。其中，II型鲨鱼源单域抗体EF73以其优异的稳定性和高效的结合能力引起了广泛关注。本研究旨在探索EF73在大肠杆菌中的表达潜力，为后续的抗体应用研究奠定基础。通过基因克隆、载体构建和转化等实验步骤，成功实现了EF73在大肠杆菌中的表达。

(2)为了评估EF73在大肠杆菌中的表达水平，我们采用了SDS和Westernblot等分子生物学技术。实验结果表明，EF73在大肠杆菌中成功表达，并且能够以可溶形式存在。通过优化表达条件，我们发现提高IPTG浓度和延长诱导时间可以显著提高EF73的表达量。此外，通过对比不同温度下的表达情况，我们发现37℃是EF73表达的最佳温度。

(3)在稳定性方面，我们对EF73在不同温度和pH条件下的稳定性进行了评估。结果显示，EF73在4℃下储存时表现出良好的稳定性，而在37℃下储存时，其稳定性有所下降。此外，通过模拟人体内的pH环境，我们发现EF73在pH7.4条件下稳定性较好，但在极端pH值下，其稳定性会受到影响。这些结果为EF73在大肠杆菌中的表达优化提供了重要的参考依据。

2.优化抗体表达条件以提高表达水平

(1)在探索II型鲨鱼源单域抗体EF73在大肠杆菌中的表达潜力过程中，我们发现表达水平与多种因素密切相关。为了提高抗体表达水平，我们系统地优化了表达条件。首先，我们对比了不同IPTG浓度对EF73表达的影响。通过实验发现，IPTG浓度从0.1mM逐步增加到1mM时，抗体表达量呈现上升趋势，但超过1mM后，表达量增长趋于平缓。因此，我们选择1mM的IPTG浓度作为后续实验的诱导条件。

(2)其次，我们考察了不同温度对EF73表达的影响。实验结果显示，随着温度的升高，EF73的表达量也随之增加。在37℃条件下，表达量达到最高。然而，过高的温度会导致蛋白质变性，影响抗体的稳定性。因此，我们选择37℃作为表达温度，并在此温度下进行后续的诱导实验。此外，我们还研究了不同诱导时间对表达水平的影响。结果显示，随着诱导时间的延长，EF73的表达量逐渐增加，但超过24小时后，表达量增长趋于平缓。因此，我们选择24小时作为诱导时间。

(3)在优化表达条件的过程中，我们还关注了宿主菌的优化。通过对比不同大肠杆菌菌株（如BL21(DE3)、E.coliJM109等）的表达情况，我们发现BL21(DE3)菌株具有更高的表达效率。因此，我们选择BL21(DE3)作为表达宿主菌。此外，我们还对表达载体进行了优化。通过在载体中添加His标签，便于后续的抗体纯化。同时，我们还对表达载体中的启动子和终止子进行了优化，以提高EF73的表达水平。在综合考虑以上因素后，我们得到了一套较为理想的抗体表达条件，为后续的抗体应用研究提供了有力保障。

3.评估抗体的稳定性和活性

(1)在完成抗体EF73在大肠杆菌中的表达后，我们对其稳定性和活性进行了全面评估。首先，我们对抗体的稳定性进行了考察。通过在不同温度（4℃、25℃、37℃）和pH值（4.0、6.0、7.4、8.0、10.0）条件下储存抗体样品，并定期进行SDS分析，发现EF73在4℃下储存时保持较好的稳定性，而在37℃下储存时，其稳定性有所下降。同时，通过pH稳定性实验，我们观察到EF73在接近生理pH值（7.4）的环境中表现出较好的稳定性，而在极端pH条件下，其稳定性显著降低。

(2)在活性评估方面，我们进行了抗体与靶标结合活性的测试。通过ELISA实验，我们检测了EF73与靶标蛋白的结合能力。结果显示，EF73能够有效地与靶标蛋白结合，表明其具有良好的结合活性。此外，我们还进行了抗体介导的细胞毒性实验，以评估EF73的安全性。在实验中，EF73对靶细胞表现出较低的细胞毒性，进一步证实了其作为治疗药物的潜力。为了进一步验证抗体的活性，我们还进行了体外功能实验，包括细胞因子释放和信号通路激活等，结果显示EF73能够有效地激活相关信号通路，表明其在治疗相关疾病中具有潜在的应用价值。

(3)最后，我们对EF73的稳定性进行了长期储存实验。在-20℃下长期储存的抗体样品在复苏后，其结合活性和细胞毒性实验结果与新鲜制备的样品相似，表明EF73在低温下具有良好的长期稳定性。此外，我们还对EF73进行了抗体纯化实验，通过亲和层析和凝胶过滤等步骤，成功纯化了高纯度的抗体。纯化后的抗体在ELISA和细胞毒性实验中表现出与原样品一致的结果，进一步证实了抗体的稳定性和活性。综上所述，EF73在大肠杆