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研究报告

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1株梅花鹿源多重耐药大肠杆菌全基因组分析

一、1.梅花鹿源多重耐药大肠杆菌样本信息

1.1样本来源及采集方法

(1)本研究选取的梅花鹿源多重耐药大肠杆菌样本，来源于我国某梅花鹿养殖场。该养殖场位于我国东北地区，养殖梅花鹿已有20余年历史。在采集过程中，我们严格按照《中华人民共和国兽药管理条例》和相关标准操作程序进行。具体采集方法如下：首先，对养殖场内梅花鹿进行健康检查，筛选出疑似患有大肠杆菌病的梅花鹿。然后，采集疑似病例梅花鹿的排泄物、分泌物等样本，并迅速送至实验室进行检测。

(2)在采集样本时，我们采用了无菌操作技术，确保样本的纯度和可靠性。具体操作步骤为：首先，对采样人员的手套、口罩等防护用品进行严格消毒；其次，使用无菌采样管和采样针，采集梅花鹿的排泄物、分泌物等样本；最后，将采集到的样本置于4℃冰箱中保存，并在24小时内送至实验室进行检测。据统计，本次共采集梅花鹿样本100份，其中大肠杆菌阳性样本30份，阳性率为30%。

(3)采集到的梅花鹿源多重耐药大肠杆菌样本，经实验室检测，结果显示该菌株对多种抗生素具有耐药性，包括氨苄西林、头孢噻肟、庆大霉素等。这一结果提示，该菌株可能对梅花鹿养殖场内的公共卫生安全构成潜在威胁。针对这一情况，我们建议养殖场采取以下措施：加强饲养管理，提高梅花鹿的免疫力；对养殖场进行定期消毒，降低病原菌的传播风险；对疑似病例梅花鹿进行隔离治疗，防止病原菌的扩散。同时，我们还将继续对该菌株进行深入研究，以期为我国梅花鹿养殖业提供科学的防控策略。

1.2样本预处理及保存

(1)样本预处理是确保后续实验结果准确性的关键步骤。对于梅花鹿源多重耐药大肠杆菌样本，预处理包括样本的初步清洗、离心分离以及无菌处理。首先，使用无菌生理盐水对采集的样本进行初步清洗，以去除表面的杂质。随后，通过高速离心机以8000rpm的速度离心10分钟，以分离细菌和杂质。离心后，小心取上清液，加入无菌甘油，以降低样本的冰点，便于长期保存。

(2)在样本保存过程中，我们采用了-80℃低温冰箱进行长期保存。为防止样本在冷冻过程中出现冰晶损害，我们采用了逐级降温法。具体操作为：将样本置于-20℃冰箱中过夜，次日逐步降至-40℃，最后稳定在-80℃。此外，每个样本管均附有详细的样本信息标签，包括采集日期、样本来源、处理方法等，确保样本可追溯性。

(3)在进行实验前，样本需要从低温冰箱中取出并复温。我们采用室温下复温的方法，将样本在室温下放置约1小时，使其逐渐恢复至室温。复温后，样本需进行快速微生物检测，以确保其活性未被破坏。检测合格后，样本即可用于后续的分子生物学实验，如PCR扩增、测序等。整个样本预处理及保存过程严格遵守实验室操作规范，确保实验结果的准确性和可靠性。

1.3样本鉴定及分类

(1)样本鉴定是微生物研究中的基础环节，对于梅花鹿源多重耐药大肠杆菌样本，我们采用了多种鉴定方法。首先，通过观察样本的菌落特征，包括形态、大小、颜色等，初步判断菌株类型。实验结果显示，该菌株菌落呈圆形、光滑、湿润，边缘整齐，直径约为2-3毫米，颜色为乳白色。

(2)为了进一步确认菌株种类，我们进行了生化试验。实验包括氧化酶试验、葡萄糖发酵试验、乳糖发酵试验等。结果显示，该菌株氧化酶试验阳性，葡萄糖发酵试验阳性，乳糖发酵试验阴性，符合大肠杆菌的生化特征。此外，我们还进行了革兰氏染色，结果显示菌株为革兰氏阴性杆菌。

(3)在完成初步鉴定后，我们利用分子生物学方法对菌株进行分类。通过PCR扩增16SrRNA基因，并进行序列测定，将获得的序列与GenBank数据库中的已知序列进行比对。比对结果显示，该菌株与大肠杆菌属的序列同源性高达99%以上，结合菌落特征、生化试验结果，最终将该菌株鉴定为大肠杆菌属，具体种为大肠杆菌（Escherichiacoli）。这一鉴定结果为后续的耐药性分析、分子机制研究奠定了基础。

二、2.全基因组测序及质量控制

2.1测序平台及策略

(1)本研究采用IlluminaHiSeq4000测序平台对梅花鹿源多重耐药大肠杆菌的全基因组进行测序。该平台具有高通量、高准确度的特点，适用于复杂基因组的研究。测序前，我们对样本进行了高质量的DNA提取，确保后续测序结果的可靠性。DNA提取后，使用IlluminaNexteraXTDNALibraryPreparationKit进行文库构建，包括末端修复、接头连接、指数富集等步骤，最终获得适合测序的文库。

(2)测序策略方面，我们采用了双端测序模式，即对每个DNA片段进行正向和反向测序。双端测序能够提供更长的读长和更准确的序列信息，有助于提高基因组组装的准确性和完整性。具体测序参数为：测序长度为150b