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1例致滇金丝猴肠炎大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

一、实验材料与方法

1.实验材料

(1)实验材料主要包括：致滇金丝猴粪便样品、LB液体培养基、LB固体培养基、营养琼脂平板、麦康凯平板、伊红美蓝平板、革兰氏染色液、生化试剂、抗生素纸片、PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、DNA标记物、PCR仪、凝胶成像系统、离心机、培养箱、显微镜、电子天平、移液器、无菌操作台等。

(2)实验所需的试剂有：无菌生理盐水、无菌水、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钙、葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、琼脂、淀粉、葡萄糖酸、乳糖、蔗糖、柠檬酸钠、硫酸铜、硫酸锌、硼酸、酚红、吲哚、硫化氢、尿素、硝酸盐还原、明胶酶、氧化酶、过氧化氢酶、柠檬酸铁、氯化钠、氯化钾、氯化钙、葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨等。

(3)实验仪器设备包括：PCR仪、凝胶成像系统、离心机、培养箱、显微镜、电子天平、移液器、无菌操作台、高压蒸汽灭菌器、振荡器、水浴锅、电子分析天平、移液枪、吸管、试管、离心管、培养皿、培养瓶、接种环、无菌滤膜、滤纸、玻璃棒、剪刀、镊子、剪刀、酒精灯、试管夹、酒精棉、消毒液等。所有实验材料均需按照国家标准或实验室规定进行购买、储存和使用，确保实验的准确性和可靠性。

2.实验方法

(1)样品采集：采用无菌操作技术，使用无菌采样管采集致滇金丝猴新鲜粪便样品。样品采集后，立即置于4℃冰箱中保存，并在24小时内进行实验室检测。采集过程中，确保采样管和手套的无菌状态，避免样品污染。

(2)分离培养：将采集到的粪便样品进行初步处理，取适量样品加入无菌生理盐水中，充分混匀后进行10倍梯度稀释。取适量稀释液接种于LB液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24小时。观察菌落生长情况，选取典型菌落进行进一步纯化。

(3)纯化菌株：将分离得到的典型菌落接种于LB固体培养基平板上，置于37℃恒温培养箱中培养24小时。观察菌落形态，选取单菌落进行纯化。将单菌落接种于新的LB固体培养基平板上，重复上述步骤，直至获得纯化菌株。纯化后的菌株保存于4℃冰箱中，备用。

(4)菌种鉴定：首先进行形态特征观察，包括菌落形态、颜色、大小、边缘等。然后进行生化鉴定试验，包括氧化酶试验、吲哚试验、硫化氢试验、明胶酶试验、尿素酶试验等。最后进行分子生物学鉴定，提取菌株DNA，进行PCR扩增，检测特异性基因片段，并与已知菌种进行序列比对。

(5)耐药性分析：采用纸片扩散法进行药敏试验。将纯化菌株接种于LB固体培养基平板上，用无菌镊子将抗生素纸片贴于平板表面，置于37℃恒温培养箱中培养24小时。观察抑菌圈大小，根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）标准进行结果判定。

(6)数据处理与分析：将实验数据录入计算机，使用统计软件进行数据分析。对菌种鉴定结果进行统计分析，包括菌落形态、生化试验结果等。对耐药性分析结果进行统计分析，包括抑菌圈大小、耐药性分布等。根据实验结果，撰写实验报告，总结实验结论。

3.实验仪器

(1)PCR仪：用于进行聚合酶链反应（PCR）实验，能够高效扩增目的DNA片段。该仪器具备预设程序功能，可根据实验需求设定温度梯度，实现DNA的变性、退火和延伸过程。仪器配备有实时荧光监测系统，便于观察PCR反应进程。

(2)凝胶成像系统：用于观察和分析凝胶电泳结果。该系统具备高分辨率成像功能，能够清晰显示DNA或RNA片段的迁移位置。系统配备有软件，可进行图像处理、定量分析等操作，方便实验数据的记录和比较。

(3)离心机：用于分离混合物中的不同组分。该仪器具备多种转速和离心力选择，可满足不同实验需求。离心过程中，样品在离心管中高速旋转，根据不同组分的密度差异实现分离。离心机配备有温度控制功能，确保实验结果的准确性。

(4)培养箱：用于微生物培养，提供恒定的温度和湿度环境。该仪器具备多种温度调节范围，满足不同微生物的生长需求。培养箱内壁采用不锈钢材质，耐腐蚀、易清洁。此外，培养箱配备有照明系统，便于观察菌落生长情况。

(5)显微镜：用于观察微生物的形态和结构。该仪器具备高倍放大功能，可清晰观察到菌体的细微结构。显微镜配备有多种光源和物镜，满足不同实验需求。显微镜操作简便，便于实验人员进行微生物观察。

(6)电子天平：用于精确称量实验样品。该仪器具备高精度和稳定性，可满足不同实验对样品量的要求。电子天平采用数字显示，便于读取数据。此外，电子天平具备自动关机功能，节省能源。

(7)移液器：用于精确移取不同体积的液体。该仪器具备多种规格和刻度，满足不同实验需求。移液器采用活塞式设计，确保液体转移的准确性。此外，移液器配备有清洗装置，便于实验过程中清洗和消毒。

二、致滇金丝猴肠炎大肠杆菌的分离

1.样品采集

(1)样品采集前，需对采集