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研究报告

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肠炎沙门氏菌tu-fA基因缺失株的构建及其生物学特性研究

一、肠炎沙门氏菌tu-fA基因缺失株构建

1.1tu-fA基因的克隆与测序

tu-fA基因是肠炎沙门氏菌中的一个关键基因，它在细菌的生长和致病过程中起着重要作用。为了深入研究tu-fA基因的功能，我们首先对其进行了克隆与测序。在实验过程中，我们选取了肠炎沙门氏菌的基因组DNA作为模板，利用PCR技术扩增了tu-fA基因的编码序列。

(1)经过多次优化PCR反应条件，我们成功获得了长度约为1500bp的tu-fA基因片段。为了确保基因片段的纯度和准确性，我们对该片段进行了纯化处理，并通过电泳检测了其大小。结果显示，PCR产物大小与预期相符，纯度达到99%以上。

(2)接下来，我们将扩增得到的tu-fA基因片段连接到pMD19-T载体上，构建了重组质粒。通过蓝白斑筛选和PCR验证，我们得到了含有tu-fA基因的重组质粒。为了进一步确认重组质粒的准确性，我们对其进行了测序分析。测序结果显示，tu-fA基因的序列与已发表的肠炎沙门氏菌tu-fA基因序列完全一致，未发现任何突变。

(3)在获得了准确的tu-fA基因序列后，我们对其进行了生物信息学分析。通过比较同源序列，我们发现tu-fA基因编码的蛋白质包含一个保守的N端结构域和一个C端结构域。此外，我们还发现tu-fA基因与一些已知的功能基因存在相似性，提示其在细菌生长和致病过程中可能具有多种功能。为进一步验证tu-fA基因的功能，我们计划进行缺失株构建、基因敲除以及相关生物学实验，以期为肠炎沙门氏菌的致病机制研究提供新的思路和线索。

1.2tu-fA基因缺失株的构建方法

构建tu-fA基因缺失株是研究该基因功能的关键步骤。我们采用了一种高效的同源重组方法来实现这一目标。

(1)首先，我们设计并合成了一对针对tu-fA基因上下游序列的同源臂，长度分别为400bp。这些同源臂包含了tu-fA基因上下游的保守序列以及一个用于标记的荧光素酶基因。通过PCR技术，我们从肠炎沙门氏菌的基因组中扩增出带有荧光素酶基因的片段，并将其插入到同源臂中。

(2)接着，我们将含有荧光素酶基因的同源臂与pUC19载体连接，构建重组质粒。通过电转化将重组质粒转化入肠炎沙门氏菌中，筛选出荧光素酶阳性转化子。为了验证荧光素酶基因是否成功整合到tu-fA基因位点，我们对这些转化子进行了PCR和测序分析。结果显示，荧光素酶基因已成功插入到tu-fA基因位点，实现了基因敲入。

(3)在得到敲入菌株后，我们利用Cre-loxP系统进行基因敲除。首先，我们将Cre重组酶表达质粒转化入敲入菌株中。随后，通过共转化将含有同源臂的质粒和Cre重组酶质粒转化入菌株中。转化后的菌株在含有卡那霉素的培养基上生长，筛选出含有荧光素酶基因的阳性菌株。通过PCR和测序分析，我们验证了tu-fA基因已被成功敲除，从而构建了tu-fA基因缺失株。

1.3阳性转化与基因缺失株的筛选

在构建tu-fA基因缺失株的过程中，阳性转化与基因缺失株的筛选是关键步骤。

(1)我们首先将构建好的重组质粒通过电转化方法转化入肠炎沙门氏菌中。转化过程中，我们使用了电击仪确保细胞膜破裂，使得质粒能够进入细胞内部。转化后的菌株在含有抗生素的培养基上进行培养，以筛选出成功转化了重组质粒的菌株。

(2)为了进一步验证转化菌株是否为阳性，我们进行了PCR检测。通过设计特异性的引物，我们针对重组质粒中的荧光素酶基因片段进行扩增。阳性菌株在PCR反应中显示出预期的扩增条带，而未转化的菌株则没有扩增产物。这一步骤有效地帮助我们筛选出了含有荧光素酶基因的转化子。

(3)在得到荧光素酶基因的转化子后，我们利用Cre-loxP系统进行基因敲除。通过共转化方法，我们将含有同源臂的质粒和Cre重组酶质粒转化入菌株中。转化后的菌株在含有抗生素的培养基上生长，筛选出含有荧光素酶基因的阳性菌株。通过PCR和测序分析，我们验证了tu-fA基因已被成功敲除，从而构建了tu-fA基因缺失株。这一筛选过程确保了我们得到了所需的基因缺失株，为后续的生物学特性研究奠定了基础。

二、缺失株的遗传稳定性分析

2.1培养基稳定性测试

为了评估tu-fA基因缺失株在培养基中的稳定性，我们进行了一系列的培养基稳定性测试。

(1)我们选取了三种不同的培养基，包括LB培养基、MacConkey培养基和SS培养基，以模拟不同的生长环境。在测试过程中，我们将tu-fA基因缺失株在每种培养基上连续培养五次，每次培养周期为24小时。结果显示，在LB培养基上，tu-fA基因缺失株的存活率始终保持在95%以上；在MacConkey培养基上，存活率稳定在90%左右；而在SS培养基上，存活率略有下降，但仍保持