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研究报告

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UDP-鼠李糖基转移酶基因SrRha在甜叶菊中的功能验证

一、实验设计

1.实验目的

(1)本实验旨在验证UDP-鼠李糖基转移酶基因SrRha在甜叶菊中的具体功能，通过基因克隆、表达载体构建、基因表达分析以及功能验证等手段，探究该基因在甜叶菊生长发育过程中的作用及其对甜叶菊产量和品质的影响。通过本研究，期望揭示SrRha基因在甜叶菊代谢途径中的调控机制，为甜叶菊的遗传改良和分子育种提供理论依据和实用技术。

(2)本研究将重点关注SrRha基因对甜叶菊次生代谢产物的合成与积累的影响，特别是对甜叶菊中具有甜味成分的鼠李糖基化程度的影响。通过比较过表达和敲除SrRha基因的甜叶菊植株的次生代谢产物含量，分析该基因在甜叶菊甜味物质合成中的关键作用，为提高甜叶菊的甜度提供新的思路和方法。

(3)此外，本实验还将探讨SrRha基因在甜叶菊抗逆性方面的作用，包括对干旱、盐胁迫等逆境的响应。通过研究SrRha基因在逆境条件下的表达水平和活性变化，以及逆境处理对甜叶菊生长和生理指标的影响，旨在揭示该基因在提高甜叶菊抗逆性中的潜在价值，为培育抗逆性强的甜叶菊新品种提供科学依据。

2.实验材料

(1)实验所用甜叶菊品种为我国自主研发的甜叶菊品种“甜菊1号”，该品种具有高糖分、低苦味、抗逆性强等特点，适合大规模种植。实验过程中，选取了生长状况良好、无病虫害的甜叶菊植株作为实验材料，每株植株生长周期为2个月，株高约为50-70厘米，叶片数20-30片。实验前，对甜叶菊植株进行充分的光照、水分和养分管理，确保其生长环境适宜。

(2)本实验所用基因克隆与表达载体构建材料包括：pET-32a(+)载体、T7噬菌体RNA聚合酶、DNA聚合酶、限制性内切酶、T4连接酶等。基因克隆过程中，以甜叶菊基因组DNA为模板，采用PCR技术扩增SrRha基因，扩增片段长度约为1500bp。在构建表达载体时，将扩增得到的SrRha基因片段插入到pET-32a(+)载体中，构建成功的表达载体命名为pET-SrRha。此外，实验中使用的T7噬菌体RNA聚合酶、DNA聚合酶、限制性内切酶和T4连接酶等均为高纯度试剂，以确保实验结果的准确性。

(3)本实验所用蛋白纯化与活性检测材料包括：Ni-NTA亲和层析柱、SDS凝胶、Westernblot试剂、酶标仪、蛋白定量试剂盒等。在蛋白纯化过程中，将表达得到的pET-SrRha融合蛋白通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，纯化得到的蛋白纯度达到95%以上。Westernblot实验中，以抗鼠Rha蛋白抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗，检测SrRha蛋白的表达水平。实验过程中，使用蛋白定量试剂盒对蛋白样品进行定量，以确保实验数据的可比性。此外，酶标仪用于检测Westernblot实验中的信号强度，确保实验结果的可靠性。

3.实验方法

(1)基因克隆与表达载体构建：首先，采用RT-qPCR技术从甜叶菊叶片中提取RNA，经反转录获得cDNA。以cDNA为模板，利用PCR扩增得到SrRha基因。随后，将扩增得到的基因片段通过限制性内切酶酶切，与经过相同酶切处理的载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆进行测序验证。然后，构建表达载体pET-SrRha，将构建好的载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，在IPTG诱导下表达融合蛋白。

(2)基因表达分析：通过实时荧光定量PCR技术检测SrRha基因在过表达和敲除组中的表达量。以甜叶菊总RNA为模板，进行cDNA合成，并以此为模板进行qPCR扩增。采用2^-ΔΔCT方法计算基因表达量的相对变化。同时，利用Westernblot技术检测SrRha蛋白的表达水平。样品进行SDS电泳后，转膜，封闭，加一抗（抗Rha蛋白抗体）和二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG），进行化学发光检测。

(3)功能验证：过表达实验中，将构建好的表达载体pET-SrRha转化大肠杆菌BL21(DE3)，在IPTG诱导下表达融合蛋白。敲除实验中，通过CRISPR/Cas9技术敲除甜叶菊中的SrRha基因，得到敲除株。通过比较过表达和敲除株与野生型株的次生代谢产物含量、生长状况和生理指标，验证SrRha基因的功能。此外，进行功能互补实验，将SrRha基因导入到敲除株中，恢复其功能，进一步验证该基因的作用。

二、材料与方法

1.甜叶菊品种选择

(1)本实验中选择的甜叶菊品种为我国自主研发的“甜菊1号”，该品种具有高糖分、低苦味、抗逆性强等特点，适合于大规模种植和工业化生产。在品种选择过程中，综合考虑了品种的甜度、生长速度、适应性以及病虫害抗性等因素。经过多轮试验和比较，最终确定“甜菊1号”为最佳实验材料，以保证实验结果的准确性和可靠性