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实验一微生物显微镜直接计数法一血细胞计数板法

一、目的规定

1.明确血细胞计数板计数的原理。

2.掌握使用血球计数板行微生物计数的方法。

二、基本原理

运用血球计数板在显微镜卜.直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将通过适

当稀释的菌悬液（或抱子悬液）放在血球计数板我玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下夕亍计数。由于计

数室的容积是一定的O（.lmm2）,所以可以根据在显微镜下观测到的微生物数目来换算成单位体枳内的微生物总

数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。

血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一

边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数

室中行。血球计数板构造如图。

血细胞计数板构造

A.正面图；B.纵切面图

（此处向下可用）计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格提成16个中方格，而每个中方格又提

成25个小方格（图10-2）；另一种是一个大方格提成25个中方格，而每个中方格又提成16个小方格（图10-2）o

但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16x25=400小方格。每一个大方格边

长为imm,则每一大方格的面积为Imm2,盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm,所以计数室

的容积为0.1mm3（万分之一亳升〕。

在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25,就得出一个大方

格中的总菌数，然后再换算成1ml函液中的总菌数。

下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例行计算：设五个中方格中总菌数为A,菌液稀释倍数为B,

那么，一个大方格中的总菌数

因1ml=1cm3=1000mm3

A

故1ml菌液中的总菌数=MX25X1（4）X3

=50000AB（个）

同理，假如是16个中方格的计数板则

A

1ml菌液中的总菌数=2x16x1Ox8

4

=40000AB（个）

三、器材

I.菌种酿酒酵母

2.仪器或其他用品血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。

四、操作环节

1.菌悬液制备

将酿酒醉母菌悬液行适当稀粒，菌液如不浓，可不必稀释。

2.镜检计数室

在加样前，先对计数板的计数室行镜检。若有污物，则需清洗吹干后才干行计数。

3.加样品

将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边沿滴一小滴

（不宜过多），让菌液沿健隙靠毛细渗透作用自行入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。

4.显微镜计数

静止5分钟后，将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进

行计数。调节显微镜光线的强弱要适当，于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边：否则视野中不

易看清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀样度后再计数。一般样品稀粹度规定每小格内约有5-10

个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只

数上方和右边线上的.如遇酵母出芽，芽体大小达成母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两