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单增李斯特菌、副溶血弧菌和沙门氏菌液相芯片检测方法的建立

一、引言

1.研究背景

(1)随着全球化和工业化进程的加快，食品安全问题日益凸显。细菌性食物中毒是全球范围内常见的食源性疾病，其中单增李斯特菌、副溶血弧菌和沙门氏菌是引起食源性疾病的主要病原菌。这些病原菌具有高度的传染性和致病性，对人类健康构成了严重威胁。为了保障食品安全，预防和控制食源性疾病的发生，对病原菌的快速、准确检测显得尤为重要。

(2)目前，传统的细菌检测方法主要包括培养法、免疫学方法和分子生物学方法等。培养法操作繁琐，耗时较长，难以满足快速检测的需求；免疫学方法特异性较高，但存在交叉反应的问题；分子生物学方法虽然具有快速、灵敏、特异等优点，但操作复杂，成本较高，限制了其在基层医疗机构的应用。因此，开发一种快速、简便、低成本、高灵敏度的病原菌检测方法，对于提高食品安全管理水平具有重要意义。

(3)液相芯片技术作为一种新型的生物传感器技术，具有高通量、高灵敏度和快速检测等优点，在病原菌检测领域具有广阔的应用前景。液相芯片技术通过将生物分子固定在微流控芯片上，实现对目标分子的检测。近年来，液相芯片技术在病原菌检测领域取得了显著进展，如针对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等病原菌的检测。本研究拟建立单增李斯特菌、副溶血弧菌和沙门氏菌的液相芯片检测方法，为食品安全检测提供一种新的技术手段。

2.研究意义

(1)本研究建立的液相芯片检测方法能够实现对单增李斯特菌、副溶血弧菌和沙门氏菌的快速、准确检测，有助于提高食品安全检测的效率和准确性。这对于保障公众健康、维护社会稳定具有重要意义。

(2)液相芯片技术在病原菌检测中的应用，有助于推动食品安全检测技术的发展，为食品安全监管提供科学依据。此外，该方法具有高通量、低成本的特点，有利于在基层医疗机构和食品生产企业的广泛应用。

(3)本研究建立的液相芯片检测方法有望为病原菌的早期诊断、流行病学调查和疾病防控提供有力支持。同时，该技术具有较好的应用前景，可为相关领域的科研人员提供新的研究思路和技术手段。

3.国内外研究现状

(1)国外对病原菌检测的研究起步较早，液相芯片技术在病原菌检测领域取得了显著成果。例如，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了基于液相芯片技术的细菌检测产品，用于临床实验室对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等病原菌的检测。据相关数据显示，液相芯片技术在病原菌检测的灵敏度和特异性方面具有显著优势，能够检测到10^-6至10^-7的细菌浓度，远高于传统方法。

(2)在我国，液相芯片技术在病原菌检测领域的研究也取得了长足进步。例如，中国科学院北京基因组研究所与相关企业合作，成功研发出基于液相芯片技术的多重病原菌检测系统，可同时检测包括沙门氏菌、副溶血弧菌在内的多种病原菌。该系统已应用于多家医院的临床检测，提高了病原菌检测的效率和准确性。据统计，我国液相芯片技术在病原菌检测市场的应用已占到了全球市场的10%以上。

(3)针对食品安全问题，国内外学者对病原菌的快速检测技术进行了深入研究。例如，欧盟委员会于2017年发布了关于食品中病原菌检测的指导文件，要求成员国采用快速、准确的检测方法。我国也于2019年发布了《食品安全国家标准食品中病原菌检测方法》，明确了食品中病原菌检测的技术要求。在实际应用中，液相芯片技术在食品安全检测中的应用案例也越来越多，如2018年，我国某食品安全检测机构利用液相芯片技术成功检测出食品中的金黄色葡萄球菌，为食品安全监管提供了有力支持。

二、材料与方法

1.实验材料

(1)实验材料主要包括病原菌标准菌株、液相芯片芯片基板、生物素标记的抗体、荧光标记的抗体、洗涤缓冲液、封闭缓冲液、酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂、核酸提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、荧光定量PCR仪、实时荧光定量PCR试剂盒、微流控芯片检测仪、超纯水、无核酸酶的DNA/RNA提取试剂盒、PCR反应混合物、荧光标记的寡核苷酸探针、DNA模板、DNA聚合酶、dNTPs、引物、蛋白酶K、SDS、EDTA、异丙醇、75%乙醇、无菌水、无菌吸头、移液器、离心机、PCR管、EP管、封口膜等。

(2)病原菌标准菌株包括单增李斯特菌、副溶血弧菌和沙门氏菌，这些菌株由我国某疾控中心提供，经过鉴定和纯化，确保了菌株的纯度和稳定性。实验过程中，对菌株进行培养、提取DNA或RNA，并按照实验要求进行PCR扩增和荧光定量PCR检测。

(3)液相芯片芯片基板由我国某生物科技公司生产，具有高密度微流控通道和生物兼容性表面，能够满足病原菌检测的需求。芯片表面预先固定了生物素标记的抗体，用于捕获病原菌抗原。荧光标记的抗体则用于检测捕获的抗原，通过荧光信号的变化判断病原菌的存在。实验过程中，对芯片进行清洗、封闭、加样