小鼠异基因造血干细胞移植中内皮祖细胞作用的量效研究.docxVIP

小鼠异基因造血干细胞移植中内皮祖细胞作用的量效研究

一、引言

异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是治疗多种恶性与非恶性血液疾病的重要手段。然而，移植后造血重建不良及相关并发症严重影响患者预后。内皮祖细胞（EPC）作为骨髓微环境的关键组分，对造血干细胞的调控至关重要。已有研究表明，EPC可促进造血重建，但其在allo-HSCT中的量效关系尚不明确。深入探究这一关系，对优化allo-HSCT治疗方案、改善患者生存质量具有重要意义。

二、材料与方法

（一）实验动物

选用8-10周龄的雄性C57BL/6（H-2Kb）小鼠作为供鼠，雌性BALB/c（H-2Kd）小鼠作为受鼠，购自[动物供应商名称]。所有小鼠饲养于特定病原体（SPF）环境，自由摄食与饮水。

（二）主要试剂与仪器

试剂：白消安（BU）、环磷酰胺（CY）、EGM-2培养基、胎牛血清（FBS）、CD45-/lowCD133+CD31+CD144+抗体、流式细胞术相关抗体、MECA32抗体等。

仪器：流式细胞仪、离心机、显微镜、细胞培养箱等。

（三）实验分组

将受鼠随机分为5组，每组10只：

正常对照组：不做任何处理。

预处理组：接受BU（4mg/kg/d，灌胃1-4天）联合CY（60mg/kg/d，腹腔注射1-2天）预处理。

单纯移植组：预处理后接受供鼠骨髓细胞（2×10^7个/只）和脾淋巴细胞（2×10^7个/只）移植。

低剂量EPC联合移植组：预处理后接受供鼠骨髓细胞、脾淋巴细胞移植，并同时输注低剂量EPC（5×10^4个/只）。

高剂量EPC联合移植组：预处理后接受供鼠骨髓细胞、脾淋巴细胞移植，并同时输注高剂量EPC（1×10^6个/只）。

（四）EPC的分离与培养

取供鼠骨髓，经密度梯度离心获取单个核细胞，接种于EGM-2培养基中，在37℃、5%CO?培养箱中培养。5-7天后，通过流式细胞术鉴定表达CD45-/lowCD133+CD31+CD144+的细胞为EPC。

（五）移植模型建立

预处理组、单纯移植组及EPC联合移植组小鼠均接受BU/CY预处理。预处理结束后，单纯移植组小鼠经尾静脉输注供鼠骨髓细胞和脾淋巴细胞；EPC联合移植组小鼠先输注相应剂量的EPC，随后输注供鼠骨髓细胞和脾淋巴细胞。

（六）检测指标与方法

外周血象检测：移植后定期采集小鼠尾静脉血，使用血细胞分析仪检测白细胞、血小板、红细胞等计数。

骨髓病理分析：在移植后不同时间点处死小鼠，取骨髓组织进行HE染色，观察骨髓造血组织形态变化。

骨髓窦内皮及微血管观察：采用MECA32抗体免疫组化染色，观察骨髓窦内皮和微血管的变化。

骨髓干、祖细胞比例分析：通过流式细胞术检测骨髓内造血干细胞（HSC）和造血祖细胞（HPC）的比例。

血清细胞因子检测：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中相关细胞因子水平，如干细胞因子（SCF）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）等。

（七）统计学分析

采用SPSS22.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P0.05为差异有统计学意义。

三、实验结果

（一）外周血象恢复情况

白细胞计数：单纯移植组外周血白细胞计数在移植后逐渐下降，第7天降至最低，随后开始回升。低剂量EPC联合移植组和高剂量EPC联合移植组白细胞计数下降幅度较小，且回升速度明显快于单纯移植组。高剂量EPC联合移植组在移植后第14天白细胞计数显著高于单纯移植组（P0.05），低剂量EPC联合移植组在移植后第21天白细胞计数与高剂量组无显著差异，但均高于单纯移植组（P0.05）。

血小板计数：单纯移植组血小板计数在移植后持续降低，至第14天左右开始缓慢上升。低剂量EPC联合移植组和高剂量EPC联合移植组血小板计数下降趋势得到明显改善，回升速度加快。高剂量EPC联合移植组在移植后第14天血小板计数显著高于单纯移植组（P0.05），低剂量EPC联合移植组在移植后第21天血小板计数与高剂量组相近，且均显著高于单纯移植组（P0.05）。

红细胞计数：三组小鼠红细胞计数在移植后变化趋势相似，但低剂量EPC联合移植组和高剂量EPC联合移植组在移植后后期红细胞计数相对稳定，且高于单纯移植组（P0.05）。

（二）骨髓病理变化

正常对照组小鼠骨髓造血组织丰富，细胞形态正常。预处理组小鼠骨髓造血组织明显减少，出现大量脂肪细胞。单纯移植组小鼠骨髓造血