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研究报告

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产低毒高效外膜囊泡沙门氏菌Re595的构建及其佐剂效力验证

一、产低毒高效外膜囊泡沙门氏菌Re595构建

1.1.菌株来源及鉴定

(1)菌株来源方面，本研究选取的沙门氏菌Re595菌株来源于我国某科研机构保存的菌种库。该菌株为革兰氏阴性杆菌，属于沙门氏菌属，具有典型的沙门氏菌形态特征。在实验室条件下，该菌株能够稳定生长，对常用抗生素具有一定的敏感性。在菌株的选取过程中，我们充分考虑了菌株的遗传稳定性、致病性以及免疫原性等因素，以确保后续研究的顺利进行。

(2)菌株鉴定方面，我们采用了一系列的微生物学鉴定方法对沙门氏菌Re595进行了详细的鉴定。首先，通过光学显微镜观察其形态，发现其为短杆状，两端钝圆，具有典型的沙门氏菌形态特征。其次，通过革兰氏染色实验，确认其为革兰氏阴性菌。此外，我们还进行了生化鉴定实验，包括氧化酶试验、动力试验、硫化氢试验等，以进一步确定菌株的种属。通过以上实验，我们确认了沙门氏菌Re595的菌种为沙门氏菌属，为后续的实验研究奠定了基础。

(3)在菌株的遗传鉴定方面，我们采用了分子生物学技术，包括PCR扩增和基因测序等方法。通过特异性引物对沙门氏菌Re595的16SrRNA基因进行PCR扩增，得到了特异性条带，进一步通过测序分析，确认了菌株的遗传学特征。此外，我们还对菌株的毒力基因进行了检测，以评估其致病性。通过这些鉴定方法，我们确保了菌株的纯度和准确性，为后续的构建和佐剂效力验证提供了可靠的菌株材料。

2.2.菌株培养与保存方法

(1)菌株培养方面，沙门氏菌Re595的培养采用营养丰富的肉汤培养基，该培养基含有牛肉浸膏、蛋白胨、氯化钠等成分，能够满足菌株的生长需求。在培养过程中，我们将菌株接种于无菌肉汤培养基中，置于37°C恒温培养箱中培养18-24小时。为了保证培养条件的稳定性，我们使用自动控温培养箱，并定期检查培养箱的温度和湿度。培养过程中，我们密切观察菌株的生长情况，包括菌落形态、颜色、透明度等，以确保菌株的正常生长。

(2)菌株保存方面，为了长期保存沙门氏菌Re595菌株，我们采用了冷冻保存法。首先，将培养好的菌株接种于无菌肉汤培养基中，在37°C恒温培养箱中培养至对数生长期。然后，将菌液移至无菌离心管中，以3000rpm的速度离心5分钟，收集菌体。接着，将菌体用无菌生理盐水洗涤两次，以去除培养基中的杂质。最后，将洗涤后的菌体加入等体积的甘油，混匀后转移至无菌冻存管中。将冻存管置于-80°C的低温冰箱中保存，以防止菌株的死亡和变异。当需要使用菌株时，将冻存管从低温冰箱中取出，置于室温下解冻，然后在37°C恒温培养箱中培养至对数生长期，即可用于后续实验。

(3)在菌株培养与保存过程中，我们严格遵循无菌操作规程，以防止菌株污染。实验室环境保持清洁，定期进行消毒处理。所有实验器材在使用前均需经过高压灭菌或化学消毒，确保无菌状态。操作人员穿着无菌操作服，佩戴无菌手套和口罩，以减少外界微生物的污染。此外，我们还对菌株的保存环境进行监控，确保菌株在保存过程中的稳定性和安全性。通过以上措施，我们确保了沙门氏菌Re595菌株在培养与保存过程中的质量和数量，为后续实验研究提供了可靠的菌株材料。

3.3.构建低毒沙门氏菌Re595的方法

(1)构建低毒沙门氏菌Re595的方法主要包括以下步骤：首先，我们选取了沙门氏菌Re595菌株的毒力相关基因作为目标基因，通过文献调研和基因数据库查询，确定了这些基因在菌株致病过程中的作用。接着，我们设计并合成了针对这些毒力基因的特异性引物，用于后续的基因敲除实验。

(2)在基因敲除实验中，我们采用了同源重组技术。首先，将目的基因的上下游同源臂序列与抗生素抗性基因构建成重组质粒，通过转化实验将重组质粒导入沙门氏菌Re595菌株中。转化后，通过抗生素筛选，得到含有重组质粒的转化子。随后，我们通过PCR和测序验证转化子的基因型，确认目标基因的同源重组是否成功。

(3)为了确保基因敲除的彻底性，我们对转化子进行了进一步的筛选和验证。首先，通过PCR检测转化子中目标基因的插入和同源臂的整合情况。其次，通过Westernblot实验检测转化子中目标蛋白的表达水平，以验证基因敲除是否影响了目标蛋白的合成。此外，我们还对转化子进行了致病性实验，通过比较转化子与野生型菌株的致病性差异，评估基因敲除对菌株毒力的影响。通过以上实验，我们成功构建了低毒沙门氏菌Re595菌株，为后续的佐剂效力验证提供了基础菌株材料。在构建过程中，我们严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可靠性。

二、构建过程中的质量控制

1.1.菌株的纯度检验

(1)菌株的纯度检验是微生物学研究中的关键步骤。在本次研究中，我们对沙门氏菌Re595菌株