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生物融合蛋白CTB-LK在向日葵中的表达研究

摘要

本研究尝试利用植物生物反应器——向日葵表达生物融合蛋白CTB-LK。首先，将具有良好的免疫佐剂和输送载体功能的CTB的基因ctb与蚓激酶LK的基因lk连接，随后构建植物双元表达载体pX6-ctb-lk，通过电击法将载体质粒导入根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株C58获得了工程菌。通过农杆菌介导法转化向日葵，经筛选，最终获得了4株具有卡那霉素抗性的向日葵再生植株，其中2株已经获得了向日葵种子。用CTAB法提取向日葵基因组DNA做PCR特异扩增，检测出3株是阳性的，这初步表明ctb-lk基因已经成功导入向日葵的细胞中。提取转基因植株的总RNA做RT-PCR，结果显示向日葵植株扩增出特异性目的片段，证明ctb-lk基因已成功整合到转基因向日葵的基因组中，并实现转录。本研究首次成功地利用向日葵表达了蚓激酶融合蛋白，有关蛋白分离纯化、活性检测及动物学实验等工作还有待进一步展开。

关键词

生物融合蛋白；CTB-LK；向日葵；基因表达

一、引言

蚓激酶（Lumbrokinase，LK）是从蚯蚓中提取的一组具有纤维蛋白溶解和血栓溶解活性的丝氨酸蛋白酶，在治疗血栓相关疾病方面具有潜在应用价值。霍乱毒素B亚基（CholeraToxinBSubunit，CTB）能够作为有效的粘膜载体分子，促进抗原递送并诱导口服耐受，已被广泛研究。将CTB与LK构建成融合蛋白CTB-LK，有望增强LK的吸收效果及抗血栓作用。植物生物反应器具有成本低、安全性高、可大规模生产等优点，向日葵作为一种易于转化和培养的植物，被选择用于表达CTB-LK融合蛋白。本研究旨在通过一系列生物技术手段，实现CTB-LK在向日葵中的表达，并对其进行初步检测。

二、材料与方法

2.1材料

2.1.1菌种与载体

根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株C58，植物双元表达载体pX6，含有ctb基因和lk基因的质粒。

2.1.2植物材料

向日葵（HelianthusannuusL.）种子。

2.1.3试剂

各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶、卡那霉素、CTAB试剂、RNA提取试剂盒等。

2.2方法

2.2.1融合基因ctb-lk的构建

以含有ctb基因和lk基因的质粒为模板，通过PCR分别扩增ctb基因和lk基因片段。设计引物时，在ctb基因片段的下游和lk基因片段的上游引入相同的限制性内切酶识别位点，以便后续连接。将扩增得到的ctb基因和lk基因片段经限制性内切酶酶切后，用T4DNA连接酶连接，获得融合基因ctb-lk。

2.2.2植物双元表达载体pX6-ctb-lk的构建

用相应的限制性内切酶将植物双元表达载体pX6切开，将上述构建好的融合基因ctb-lk连接到pX6载体上，构建成植物双元表达载体pX6-ctb-lk。将构建好的载体转化到大肠杆菌DH5α中，通过菌落PCR和测序验证载体构建的正确性。

2.2.3农杆菌工程菌的获得

将测序正确的pX6-ctb-lk载体质粒通过电击法导入根癌农杆菌C58中。将电击后的农杆菌涂布在含有相应抗生素的固体培养基上，筛选出含有重组质粒的农杆菌菌落，即获得工程菌。通过PCR验证工程菌中是否含有ctb-lk基因。

2.2.4向日葵的遗传转化

选取饱满的向日葵种子，消毒后接种在诱导愈伤组织的培养基上。待愈伤组织形成后，将其与上述获得的农杆菌工程菌共培养。共培养后，将愈伤组织转移到含有卡那霉素的筛选培养基上进行筛选，获得抗性愈伤组织。将抗性愈伤组织进一步诱导分化，获得再生植株。

2.2.5转基因向日葵的分子检测

采用CTAB法提取再生植株的基因组DNA，以其为模板，用特异性引物对ctb-lk基因进行PCR扩增，检测基因是否整合到向日葵基因组中。同时，提取转基因植株的总RNA，反转录成cDNA后，进行RT-PCR，检测ctb-lk基因是否转录。

三、结果

3.1融合基因ctb-lk及植物双元表达载体pX6-ctb-lk的构建结果

通过PCR扩增得到了预期大小的ctb基因和lk基因片段，连接后获得了融合基因ctb-lk。将其连接到pX6载体上，经菌落PCR和测序验证，表明植物双元表达载体pX6-ctb-lk构建成功。测序结果显