基因组改组技术驱动耐酸性琥珀酸放线杆菌选育的研究与实践.docxVIP

基因组改组技术驱动耐酸性琥珀酸放线杆菌选育的研究与实践

一、引言

1.1研究背景与意义

琥珀酸，又名丁二酸，作为一种关键的C4平台化合物，在众多领域发挥着不可或缺的作用。在制药行业，琥珀酸可作为药物合成的重要原料，用于生产多种具有特定疗效的药物；在食品添加剂领域，它能够增添食品的酸味和鲜味，改善食品的口感和风味，同时还可作为防腐剂延长食品的保质期；在绿色溶剂方面，琥珀酸基溶剂具有良好的溶解性和环境友好性，可替代传统的挥发性有机溶剂，减少对环境的污染；而在可降解塑料的制备中，琥珀酸是合成生物可降解聚酯的重要单体，有助于解决传统塑料带来的“白色污染”问题。随着全球对可持续发展的关注度不断提高，琥珀酸作为一种具有广泛应用前景的生物基化学品，其市场需求呈现出快速增长的趋势。

目前，琥珀酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法。化学合成法通常依赖于石化原料，如石蜡氧化法、反丁烯二酸加氢法等。然而，这些方法存在诸多弊端，不仅生产成本高昂，而且在生产过程中会产生大量的污染物，对环境造成严重的压力。相比之下，微生物发酵法以其独特的优势成为国际上的研究热点。微生物发酵法能够利用可再生的农业资源，如糖类、淀粉等作为原料，摆脱了对石化原料的依赖，从源头上降低了生产成本。同时，该方法在相对温和的条件下进行，反应过程中产生的废弃物较少，对环境更加友好。此外，发酵法生产琥珀酸还具有能耗低、产品纯度高、易于规模化生产等优点。

在微生物发酵生产琥珀酸的过程中，菌株的性能对发酵效率和产品质量起着决定性的作用。琥珀酸放线杆菌是目前研究较多的琥珀酸生产菌株之一，它能够利用多种碳源进行生长和代谢，产生较高浓度的琥珀酸。然而，该菌株在发酵过程中对酸性环境较为敏感，随着发酵的进行，发酵液中的pH值会逐渐下降，这不仅会抑制菌株的生长和代谢活性，还会导致琥珀酸产量的降低。因此，选育耐酸性琥珀酸放线杆菌具有至关重要的意义。

耐酸性琥珀酸放线杆菌能够在较低的pH值条件下保持良好的生长和产酸性能，这对于提高琥珀酸的发酵效率和降低生产成本具有重要作用。一方面，耐酸性菌株可以减少发酵过程中pH值调节的成本。在传统的发酵工艺中，为了维持适宜的pH值环境，通常需要添加大量的碱性物质，如碳酸钙、碳酸钠等，这不仅增加了原材料的成本，还会产生大量的副产物，增加后续分离和纯化的难度。而耐酸性菌株能够在较低的pH值下生长，从而减少了碱性物质的使用量，降低了生产成本。另一方面，耐酸性菌株可以缩短发酵周期。由于耐酸性菌株能够在酸性环境中保持较高的代谢活性，其生长速度和产酸速度相对较快，从而可以缩短发酵周期，提高生产效率。此外，耐酸性菌株还可以减少杂菌污染的风险。在较低的pH值环境下，许多杂菌的生长会受到抑制，从而降低了杂菌污染的可能性，保证了发酵过程的稳定性和产品质量。

综上所述，选育耐酸性琥珀酸放线杆菌对于推动微生物发酵法生产琥珀酸的工业化进程具有重要的现实意义。它不仅能够降低生产成本，提高生产效率，还能够减少环境污染，符合可持续发展的战略要求。因此，开展耐酸性琥珀酸放线杆菌的选育研究具有广阔的应用前景和重要的科学价值。

1.2国内外研究现状

基因组改组技术作为一种新兴的菌种选育技术，近年来在微生物领域得到了广泛的关注和应用。该技术的发展历程可以追溯到20世纪90年代，1994年，Stemmer首先提出了在体外定向进化分子的方法——DNAshuffling技术。其原理是将同源的DNA用DNAaseI进行消化成片段，然后将得到的随机片段无引物PCR，使之重新随机装配，从而获得了多种排列组合的突变基因库，最后利用设计好的引物PCR，得到预期的重组体。1998年，Stemmer等又提出了genomeshuffling（全基因组改组），该方法首先选择一个原始亲株，通过经典的诱变育种方法获得多个表型得到提高的菌株，构建突变候选株文库，以这些表型提高的菌株作为首轮多亲本融合的直接亲株，然后进行多亲株融合，使其全基因组进行随机重组，获得第一代融合株；再从中选择表型获得进一步提高的菌株作为下一轮融合的直接亲本，依此类推进行多轮的多亲株融合，最终从获得的突变体库中筛选出性状被提升的目的菌株。

基因组改组技术在微生物选育中展现出了显著的优势。它融合了诱变育种和原生质体融合技术的优点，能够在较短的时间内获得具有优良性状的菌株。与传统的诱变育种相比，基因组改组技术可以同时对多个基因进行操作，扩大了变异范围，增加了获得高产突变菌株的机会。例如，在Ying-XinZhang等人的研究中，以4株营养缺陷型的泰乐菌素的生产菌，弗氏链霉菌（Streptomycesfradiae）为模型进行重组。四轮无选择性条件的原生质体融合再生结果表明，后代