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定向进化策略提升羧酸酯酶E.coliBioH活性的研究与应用

一、引言

1.1研究背景与意义

羧酸酯酶E.coliBioH作为一种在微生物中广泛存在的酶，在工业和生物领域展现出了巨大的应用潜力。在工业生产中，它能够参与多种化学反应，例如在制药行业，可用于手性药物的合成与拆分，利用其对特定底物的选择性催化能力，能够高效地制备单一构型的手性药物分子，提高药物的疗效和安全性。在食品工业中，它可用于油脂的水解与合成，通过精确控制反应条件，能够生产出具有特定结构和功能的油脂产品，满足不同食品加工的需求。在生物领域，羧酸酯酶E.coliBioH在生物素合成途径中扮演着不可或缺的角色，它参与了生物素合成过程中的关键步骤，对维持细胞内生物素的平衡以及细胞的正常生理功能起着重要作用。

然而，野生型的羧酸酯酶E.coliBioH的水解活性和酰化活性在实际应用中受到一定限制。其水解活性较低，导致在催化酯类化合物水解时，反应速率较慢，需要较长的反应时间才能达到预期的转化率，这不仅增加了生产成本，还降低了生产效率。在一些需要快速水解酯类物质的工业生产过程中，如生物柴油的制备，低水解活性使得反应难以在短时间内完成，影响了生产的连续性和规模化。其酰化活性也不够理想，在参与酰化反应时，对底物的亲和力和催化效率不高，导致酰化产物的产率较低，难以满足工业生产对高产量的需求。在香料合成等领域，需要高效的酰化反应来制备具有特定香气的酯类化合物，而低酰化活性限制了该酶在这些领域的应用。

定向进化技术为解决羧酸酯酶E.coliBioH活性受限的问题提供了有效途径。定向进化通过在体外模拟自然进化过程，利用易错PCR、DNA改组等技术，对酶基因进行随机突变和重组，构建出包含大量突变体的基因文库。然后，结合高通量筛选技术，从基因文库中筛选出具有更高水解活性和酰化活性的突变体。这种方法能够在短时间内创造出丰富的酶分子多样性，打破了传统理性设计对酶结构和功能认知的限制，即使在对酶的结构和催化机制了解有限的情况下，也能有效地提高酶的性能。通过定向进化提高羧酸酯酶E.coliBioH的活性，不仅可以拓展其在工业和生物领域的应用范围，还能降低生产成本，提高生产效率，具有重要的理论意义和实际应用价值。

1.2研究目的与内容

本研究旨在通过定向进化技术，显著提高羧酸酯酶E.coliBioH的水解活性和酰化活性，为其在工业和生物领域的广泛应用奠定基础。

在研究内容方面，首先利用易错PCR技术对羧酸酯酶E.coliBioH基因进行随机突变。通过优化易错PCR的反应条件，如Mg2?浓度、dNTP比例、TaqDNA聚合酶用量等，控制突变频率在合适范围内，以获得高质量的突变基因文库。然后将突变后的基因与表达载体连接，转化到大肠杆菌BL21中，构建突变体文库。利用以对硝基苯乙酸酯为底物的平板筛选法，对突变体文库进行初步定性筛选，挑选出在平板上产生明显水解圈的突变体。再通过酶标仪测定突变体酶液在特定波长下的吸光值变化，对初步筛选出的突变体进行定量活性测定，确定水解活性显著提高的突变体。

对筛选得到的高水解活性突变体进行热稳定性及表达量的研究。通过测定突变体在不同温度下的半衰期，评估其热稳定性；利用SDS电泳和蛋白质定量试剂盒，分析突变体蛋白的表达量，探究突变对蛋白表达和稳定性的影响，并对突变位点进行定位和分析，为进一步理解突变机制提供依据。

测定野生型BioH及其突变体库对于酰化活性。以1-苯乙胺和1-苯乙醇为底物，在不同反应条件下（如温度、pH值、底物浓度等），检测野生型和突变体BioH的酰胺化和酯化活性，分析突变对酰化活性的影响。针对酰化活性有提高趋势的突变体，根据其突变位点信息，采用定点突变技术进行组合突变，构建新的突变体。通过活性检测，筛选出酰化活性进一步提高的突变体，深入研究突变位点之间的协同作用对酶酰化活性的影响。

本研究的技术路线如下：首先开展羧酸酯酶E.coliBioH基因的易错PCR随机突变，构建突变体文库，进行水解活性的筛选；接着对筛选出的突变体进行热稳定性和表达量分析以及突变位点定位；然后测定野生型和突变体库的酰化活性；最后进行定点组合突变提高酰化活性，对获得的高活性突变体进行全面表征和分析。

1.3国内外研究现状

国内外众多科研团队致力于利用定向进化提高羧酸酯酶活性的研究，并取得了一系列重要成果。江南大学生物工程学院倪晔教授团队在机器学习辅助酶立体选择性的定向进化方面取得突破。他们以手性环己-3-烯-1-羧酸（CHCA）为底物，开发高通量方法生成羧酸酯酶AcEst1的高质量数据集，利用羧酯酶的生化特征训练包括核岭回归（KRR）、高斯过程回归（GPR