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拟南芥双油体系统中KGF-2的表达特性与生物活性探究

一、引言

1.1研究背景与意义

角质细胞生长因子-2（KeratinocyteGrowthFactor-2，KGF-2），又称成纤维细胞生长因子-10（FibroblastGrowthFactor-10，FGF-10），作为成纤维细胞生长因子（FGFs）家族的重要成员，在医学和生物领域展现出极为关键的作用。KGF-2由208个氨基酸组成，其独特的结构赋予了它特殊的生物学功能。在胚胎发育进程中，KGF-2参与并精准调控多种组织和器官的形成与分化，是胚胎器官发育不可或缺的多功能信号分子。如在脊椎动物四肢、牙齿和毛发（羽毛），以及肺、耳、盲肠、颌下腺、胰腺和前列腺等器官的形成过程中，KGF-2均发挥着极为重要的作用。在组织修复领域，KGF-2通过与上皮细胞细胞膜上的受体特异性结合，能够高效促进上皮细胞的增殖、分化和迁移。当组织遭受损伤时，KGF-2可以刺激表皮细胞的增殖、迁移和分化，直接推动伤口的愈合进程，在组织的重塑过程中发挥趋化作用；同时，它还能通过刺激其它在组织修复和再生过程中有着非常重要作用的细胞因子（如血小板衍生生长因子，转化生长因子和成纤维细胞生长因子）的表达，来间接作用于组织的重塑。临床研究也表明，KGF-2对角膜修复具有显著效果，能够加速角膜上皮损伤的愈合，抑制角膜新生血管和角膜瘢痕形成，有效提高角膜透明度，在眼科疾病治疗中具有广阔的应用前景；在应对辐射对正常组织和胃肠道黏膜造成的损伤时，KGF-2同样表现出一定的防护和修复作用，为相关疾病的治疗提供了新的策略和希望。

目前，KGF-2的生产主要依赖微生物发酵、动物细胞培养等传统表达系统。微生物发酵，如大肠杆菌表达系统，虽具有基因导入方便、生产成本较低、短期内可大量表达蛋白等优势，但表达产物容易形成包涵体，使得纯化步骤繁杂，大大提高了生产成本；并且该系统属于原核生物表达系统，无法进行糖基化、正确折叠等蛋白翻译后加工步骤，这使得许多真核基因无法利用该系统生产；此外，利用大肠杆菌表达系统生产的重组医用、食用蛋白，其热源性物质难以去除，人服用后易引起发烧等毒副反应，发酵设备昂贵也限制了其大规模应用。酵母表达系统虽具有大肠杆菌表达系统的一些优点，且属于真核生物，能够表达部分糖蛋白，表达产物可分泌型表达利于工业化规模生产，但酵母细胞具有转移高甘露糖功能，造成其糖蛋白产物具有较强的抗原性并容易在血液循环中被降解，表达的糖蛋白产物与天然产物在结构上也存在较大差异，从而限制了其应用范围。昆虫细胞/杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞表达系统虽可成功表达多种真核基因，产物构象与天然产物接近，表达量较高，且可进行磷酸化、酰化等其他翻译后修饰，但其成本很高，需特殊的培养基和培养设备，分离纯化步骤较为繁杂，同时受生物量小、培养周期长等限制，难以进行大规模生产。

植物生物反应器作为一种新兴的外源蛋白表达系统，具有诸多独特优势。植物生长过程中可利用太阳能进行光合作用，无需复杂的发酵设备和昂贵的培养基，大大降低了生产成本；植物细胞具有完整的真核细胞结构，能够进行糖基化、磷酸化等多种蛋白翻译后修饰，保证表达的外源蛋白具有正确的折叠和生物活性；此外，植物生长环境相对安全，无潜在致病的热源与内毒素，避免了传统表达系统可能带来的病毒、支原体等污染问题。拟南芥作为植物生物学研究中的模式植物，在植物生物反应器领域具有不可替代的地位。它生长周期短，从种子萌发到产生种子仅需数周时间，大大缩短了实验周期，提高了研究效率；基因组小且已被完全测序，使得基因操作和功能研究更加便捷和深入；易于遗传转化，能够高效地将外源基因导入其基因组中，实现外源蛋白的表达；种植和栽培条件相对简单，对生长环境要求不苛刻，可在实验室和大规模种植环境中生长，便于大规模生产外源蛋白。

拟南芥双油体系统是基于植物油体表达系统发展而来的一种新型表达策略。植物油体是种子中储存油脂的亚细胞结构，由半单位膜包裹液态三酰甘油（TAG）形成球体，表面镶嵌着油素蛋白（oleosin）。油素蛋白具有高表达性和易分离特性，利用这一特性构建的油体表达系统可有效改进植物生物反应器下游加工技术。拟南芥双油体系统通过在KGF-2蛋白的两端融合油素蛋白，形成双油体KGF-2融合蛋白。这种融合表达策略不仅能够利用油素蛋白的高表达特性提高KGF-2的表达量，还能借助油素蛋白与油体的亲和性，使融合蛋白特异性地定位到油体中，便于后续的分离和纯化。研究表明，与单油体表达载体相比，双油体融合表达策略可使KGF-2蛋白表达量提高2.5倍左右，为KGF-2的大规模生产提供了新的技术途径。

本研究聚焦于KGF-2在拟南芥双油体系统中的表达及其生物活性研究，具有重