毕赤酵母高效表达猪胰高血糖素样肽 - 2及其生物活性的深度解析.docxVIP

毕赤酵母高效表达猪胰高血糖素样肽-2及其生物活性的深度解析

一、引言

1.1研究背景与意义

猪胰高血糖素样肽-2（PorcineGlucagon-likePeptide-2，pGLP-2）作为一种重要的多肽激素，在调节猪的胃肠道功能、促进肠道发育和修复以及维持肠道屏障完整性等方面发挥着关键作用。在畜牧业中，仔猪阶段是生长发育的关键时期，但常面临肠道功能不完善、腹泻等问题，影响生长性能和存活率。pGLP-2能够促进肠道绒毛生长、刺激肠道隐窝内细胞增殖分化，提高营养物质的消化吸收能力，对改善仔猪肠道健康、提高养殖效益具有重要意义。此外，pGLP-2在人类医学领域也备受关注，其在治疗肠道炎症性疾病如短肠综合征、肠炎性腹泻等方面展现出潜在的应用价值。

然而，天然来源的pGLP-2含量极低，从猪胰等组织中提取难度大、成本高，且产量难以满足大规模研究和应用的需求。化学合成pGLP-2虽然可行，但工艺复杂、成本高昂，并且在合成过程中容易引入杂质，影响产品质量和活性。因此，寻找一种高效、低成本的pGLP-2表达方法成为当前研究的热点。

毕赤酵母表达系统作为一种常用的真核表达系统，在表达外源蛋白方面具有独特的优势。首先，毕赤酵母具有强有力的醇氧化酶（AOX）启动子，可利用甲醇严格调控外源基因的表达，使得目的蛋白的表达能够在特定条件下高效进行，减少不必要的能量消耗和蛋白降解。其次，毕赤酵母的表达水平高，既能在胞内表达，也能实现分泌型表达，便于蛋白的分离和纯化。再者，其发酵工艺成熟，易于放大，可实现大规模工业化生产，降低生产成本。同时，毕赤酵母培养成本低，所用发酵培养基主要为无机盐、甘油或葡萄糖及甲醇等，成分简单且廉价，有利于下游产品的分离纯化。此外，作为真核表达系统，毕赤酵母具备真核生物的亚细胞结构，能够对表达的蛋白进行糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工，使表达的蛋白更接近天然状态，具有更好的生物活性和稳定性。基于以上优势，毕赤酵母表达系统在生物制药、工业酶生产等领域得到了广泛应用。

本研究旨在探索猪胰高血糖素样肽-2在毕赤酵母中的分泌表达，通过优化表达条件，提高pGLP-2的表达量和纯度，并对其生物活性进行深入研究。这不仅有助于深入了解pGLP-2的生物学功能和作用机制，为其在畜牧业和医学领域的应用提供理论基础，而且对于开发新型的肠道健康调节剂和药物具有重要的实践意义，有望推动相关产业的发展，带来显著的经济效益和社会效益。

1.2国内外研究现状

在国外，对胰高血糖素样肽-2的研究起步较早。早在1996年，就有研究明确了其在促进肠道生长和修复方面的关键作用，证实它能够刺激肠道隐窝细胞的增殖，抑制细胞凋亡，从而有效促进肠道黏膜的生长。后续研究进一步深入探讨了GLP-2的作用机制，发现它通过与肠道上皮细胞表面的特异性受体结合，激活下游的细胞内信号通路，如ERK1/2和Akt等信号途径，进而调节细胞的增殖、分化和存活。在表达方面，国外科研人员尝试了多种表达系统来生产GLP-2。例如，利用大肠杆菌表达系统进行表达，但由于大肠杆菌缺乏真核生物的翻译后修饰机制，表达出的GLP-2往往需要复杂的复性过程来获得活性，且容易形成包涵体，导致产量和活性受到限制。相比之下，毕赤酵母表达系统因其具有真核生物的优势，受到了广泛关注。已有研究成功在毕赤酵母中表达了GLP-2，并对表达条件进行了初步优化，包括对培养基成分、诱导时间和温度等因素的研究，以提高表达量和蛋白活性。同时，通过对毕赤酵母的基因工程改造，如优化信号肽序列、调整启动子强度等，进一步提高了GLP-2的分泌表达水平和蛋白质量。

在国内，对猪胰高血糖素样肽-2的研究也取得了一定进展。科研人员通过基因克隆技术成功获得了猪源GLP-2的基因序列，并对其进行了序列分析和功能预测。在表达研究方面，同样尝试了多种表达系统，其中毕赤酵母表达系统是研究的重点之一。相关研究通过构建合适的表达载体，将猪GLP-2基因导入毕赤酵母中进行表达，并对表达产物进行了纯化和鉴定。利用亲和层析、离子交换层析等技术，成功获得了较高纯度的重组猪GLP-2蛋白，并通过SDS-PAGE、Westernblot和质谱等方法对其进行了鉴定和定量分析。在生物活性研究方面，国内研究通过细胞实验和动物实验，验证了重组猪GLP-2对肠道上皮细胞的增殖促进作用，以及对实验动物肠道损伤的修复效果，为其在畜牧业和医学领域的应用提供了实验依据。

尽管国内外在猪胰高血糖素样肽-2的研究方面取得了诸多成果，但仍存在一些不足之处。一方面，在毕赤酵母中表达猪胰高血糖素样肽