干细胞基础与临床应用基础研究演示文稿.pptVIP

***************************根据其它细胞特性的分离方法2二、有丝分裂抑制剂法原理：有丝分裂后细胞（不再分裂增殖的细胞，如神经细胞）不受有丝分裂抑制剂的影响，可分裂细胞明显受其抑制逐渐消亡。常用抑制剂：阿糖胞苷（Ara-C）、氟尿嘧啶（FU）第30页，共53页。三、原代培养1原代培养的概念：1、是指“初次培养”的含义，没有培养物的分割。2、“代”只是分割的记录与记数形式，与细胞分裂增殖的“代”不同。3、植块培养也可以分割，故也可以进行传代培养4、更换培养液、更换培养器皿，仍是原代培养。第31页，共53页。三、原代培养2基本目的：1、维持目的细胞在体外条件下生存一段时间,适应体外培养的新环境。2、更接近原来的组织形式，有利于目的细胞适应体外培养的新环境。3、使目的细胞在体外条件下稳定生长、扩增，形成优势群体。第32页，共53页。三、原代培养3植块培养植块培养目的：1、观察组织生长行为及其规律。2、获得向外迁移的细胞（应该有相应的松解、离散措施）。植块培养的优点：保持了良好的3D组织结构、维持了细胞之间的相互作用，细胞易于成活和生长。植块培养的缺陷：植块中央的物质交换受局限。适宜大小！1mm3植块培养的关键：1、植块的贴壁、固定。2、培养液的添加。3、如果是为了获得细胞，要注意植块的适时移出。第33页，共53页。三、原代培养4细胞培养优点：能在特定条件下，获得单一类型的细胞并进行相关的研究。关键：使细胞尽快进入分裂、增殖的生长状态。1、促进细胞贴壁2、适宜的细胞接种密度。105个/ml是常用的标准，但还应该考虑细胞类型、生长能力、活力。干细胞的培养会选择更低密度？第34页，共53页。三、原代培养5培养空间3、培养空间构建适宜的培养体系：培养体系由两大部分组成：液相和气相调整培养空间的目的：保证细胞的供O2量相关参数：（1）、液相∶气相=1∶10（体积）（2）、液相高度：2～5mmO2O2O2第35页，共53页。四、传代培养1传代的目的：1、避免接触性抑制，保持细胞稳定地生长。2、进一步纯化细胞类型。（1）不同的传代处理方式（2）不同的处理强度传代的指标：1、体细胞：集落占据80%～90%的瓶底面积。2、干细胞：根据目的细胞集落的生长状况，有必要时。第36页，共53页。四、传代培养2传代的基本步骤：1、换液一些技术手册要求传代前一天换液，主要是改善细胞状态，增强适应能力。2、解离细胞目的细胞的生物学特性决定解离细胞方法酶消化法机械震荡法3、再次接种传代的关键：1、适当的时间2、适当的方法3、适当的细胞密度第37页，共53页。五、“二倍体细胞”的问题细胞性状的稳定，是体外培养条件下，研究体内细胞生物学性状的前提。问题：在较长时间和不适宜条件下的体外培养，由于细胞融合等已知和未知的原因，细胞的染色体倍数会发生变化，成为多倍体细胞。营养条件理化条件生活环境遗传物质基础传代第38页，共53页。六、体外培养细胞的生长与观察1在体外培养条件下，细胞的生长行为会有相应的变化，对其研究的目的是：1、了解细胞的生长行为的基本规律；2、区分质变与量变，判断目的细胞的价值和意义。A、体外培养细胞的生长方式：1、黏附型2、悬浮型第39页，共53页。六、体外培养细胞的生长与观察2黏附型细胞黏附是体外培养条件下恢复“组织形式”的倾向1、细胞与细胞之间的接触2、细胞与细胞外基质结合体内、体外的差异：体内是立体三维的结构；而体外只是二维的空间，大多数情况下只有一个附着面。故细胞的外形会有变化。第40页，共53页。六、体外培养细胞的生长与观察3黏附型细胞的类型：1、上皮型细胞（上皮样细胞）：细胞镶嵌状紧密排列，呈“铺路石样”；起源于内胚层、外胚层的细胞多呈此型。第41页，共53页。六、体外培养细胞的生长与观察42、成纤维细胞（成纤维细胞样）：细胞梭形、多角形、胞体铺展，细胞间隙较大，细