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基于CRISPR/Cas9技术构建TERC基因敲除大鼠及特性探究

一、引言

1.1研究背景与意义

1.1.1CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展与应用

基因编辑技术自诞生以来，便在生命科学领域掀起了巨大的变革浪潮。从早期的同源重组技术，到锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活样效应因子核酸酶（TALENs），再到如今备受瞩目的规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白系统（CRISPR/Cas），每一次技术的革新都推动着基因研究向前迈进一大步。

CRISPR/Cas系统最初源于细菌和古细菌的一种适应性免疫防御机制。在漫长的进化过程中，细菌为了抵御噬菌体等病毒的入侵，逐渐演化出了CRISPR/Cas系统。当病毒首次入侵细菌时，细菌会将病毒的部分DNA片段整合到自身基因组的CRISPR序列中，形成间隔序列。当病毒再次入侵时，CRISPR序列会转录产生CRISPRRNA（crRNA），crRNA与反式激活crRNA（tracrRNA）结合形成复合物，引导Cas蛋白识别并切割入侵病毒的DNA，从而保护细菌免受侵害。

2012年，JenniferDoudna和EmmanuelleCharpentier等科学家在对CRISPR/Cas系统的研究中取得了重大突破，他们首次证实了CRISPR/Cas9系统能够在体外对特定的DNA序列进行切割，这一发现为基因编辑领域开辟了新的道路。次年，张锋等人成功将CRISPR/Cas9技术应用于哺乳动物细胞的基因编辑，进一步推动了该技术在生命科学研究中的广泛应用。由于在CRISPR-Cas9基因编辑技术上做出的卓越贡献，JenniferDoudna和EmmanuelleCharpentier获得了2020年诺贝尔化学奖。

CRISPR/Cas9系统主要由Cas9蛋白和向导RNA（sgRNA）组成。sgRNA能够识别并结合到目标DNA序列上，引导Cas9蛋白对目标DNA进行切割，从而产生双链断裂（DSB）。细胞内的DNA修复机制会对DSB进行修复，主要包括非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）两种方式。NHEJ修复过程简单快速，但容易在修复位点引入插入或缺失突变，导致基因功能丧失，常用于基因敲除；HR修复方式则需要提供外源的同源模板，能够实现对基因的精确编辑，如基因敲入、点突变修复等，但修复效率相对较低。

凭借其操作简便、成本低廉、效率高等优势，CRISPR/Cas9技术在基因编辑领域迅速占据了重要地位，成为了科研人员手中强有力的研究工具。在医疗领域，该技术为基因治疗带来了新的希望，有望攻克许多传统医学难以治愈的遗传性疾病。例如，镰状细胞贫血是一种由于基因突变导致的血液疾病，患者的红细胞呈镰刀状，容易破裂，引起贫血等一系列症状。利用CRISPR/Cas9技术，科学家可以对患者造血干细胞中的致病基因进行编辑修复，使其恢复正常功能，为镰状细胞贫血的治疗提供了新的策略。在癌症治疗方面，CRISPR/Cas9技术也展现出了巨大的潜力。通过敲除或编辑肿瘤细胞中的关键致癌基因，或者增强免疫系统对肿瘤细胞的识别和攻击能力，有望开发出更加有效的癌症治疗方法。

在农业领域，CRISPR/Cas9技术为作物育种带来了革命性的变化。通过精准编辑作物的基因，可以培育出具有优良性状的新品种，如提高作物的抗病性、抗逆性、产量和品质等。例如，科学家利用CRISPR/Cas9技术对水稻的基因进行编辑，成功培育出了对稻瘟病具有高抗性的水稻品种，有效减少了农药的使用，提高了粮食产量和质量，为保障全球粮食安全做出了重要贡献。在基础科学研究中，CRISPR/Cas9技术帮助科学家深入探究基因的功能和调控机制，加速了生命科学领域的研究进程。通过构建基因敲除或敲入的细胞模型和动物模型，科研人员可以研究特定基因在生理和病理过程中的作用，为揭示生命奥秘提供了有力支持。

1.1.2TERC基因的研究现状

TERC基因，全称为端粒酶RNA组分（TelomeraseRNAComponent）基因，在细胞的生命活动中扮演着至关重要的角色。人类TERC基因位于3号染色体长臂，其编码的RNA是端粒酶的核心功能组分。端粒酶是一种核糖核蛋白聚合酶，它能够以TERC为模板，合成端粒DNA序列，添加到染色体末端，从而维持端粒的长度和稳定性。端粒是存在于真核细胞染色体末端的DNA-蛋白质复合体，它就像染色体末端的“保护帽”，能够保护染色体免受降解、融合和重组等损伤，对维持基因组的稳定性至关重要。

在正常体细胞中，端粒酶的活性通常受到严格调控，表达水平较低。随着细胞的不断分裂，端粒会逐渐缩短，当端粒缩短到