短链的寡聚核苷酸的序列测定教育课件.pptVIP

短链的寡聚核苷酸的序列测定PPT讲座;DNA的测序是分子生物学研究中非常重要和关键的内容。对DNA一级结构的研究，有助于探索基因结构与功能、基因与疾病关系，进而推动生命科学研究获得质的飞跃。测定基因组的全部核苷酸序列、阅读和分析全部遗传信息，正是人类基因组计划（humangenomeproject,HGP)的最主要目标之一。;将DNA片段用荧光等分析仪，测出DNA序列碱基排列顺序。

DNA序列测定方法：

1.Sanger的双脱氧法：A/T/G/C四个反应。

2.化学降解法：G反应；G+T反应；T+C反应和C反应。

3.自动测序法。;DNA测序的主要方法有两种，即双脱氧链终止法（Sanger法、酶促法）和化学裂解法（Maxam-Gelbert法）。二者均依赖于高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。不管是酶促法还是化学法，都是分为4个反应体系进行测序反应，寡核苷酸链分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基。4种反应体系的寡核苷酸链产物，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影后，读出待测DNA的连续序列。;;一、Sanger双脱氧链终止法;不能再与其它的脱氧核苷酸形成3′,5′-磷酸二酯键，DNA合成便在此处终止，如果此处掺入的是一个ddATP，则新生链的末端就是A，依次类推可以通过掺入ddTTP、ddCTP、ddGTP，则新生链的末端为T、C或G，根据这个原理，Sanger与1977年建立了双脱氧链终止测序法。他本人也因此而获得了诺贝尔奖。;Sanger;双脱氧核苷三磷酸;以单链或双链DNA为模板，采用DNA引物引导新生DNA的合成，因此又称为引物合成法，或酶促引物合成法。主要是基于DNA聚合酶的催化特性：①以DNA为模板，根据碱基配对的原则逐个将dNTP加到与模板结合的寡核苷酸引物的3′-OH末端，形成正确的模板DNA互补链；②能以dNTP作为底物，也能利用ddNTP作底物，将其掺入寡核苷酸链的3′末端而终止新生互补链的延伸。;如果在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的脱氧核苷三磷酸（dNTP）外，再加入一种少量的2ˊ,3ˊddNTP，那么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。

在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的ddNTP，结果将生成4组??苷酸链，它们将分别（随机）终止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。对这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。;在测序反应中通常设置4个反应，各反应管中同时加入一种DNA模板和引物、DNA聚合酶I（失去5′3′外切核酸酶活性）、其中一管中分别加入一种ddNTP（如ddTTP、dTTP）以及其它三种dNTP（dATP、dCTP、dGTP），引物末端用放射性核素标记，ddTTP的比例很小（1:10），因此掺入的位点是随机的，经过适当的条件下温育，将会有不同长度的DNA片段合成。它们都具有相同的5′末端，3′末端都因掺入了ddTTP而以T结尾。在其它三管中同理加入相应的ddNTP。;Sanger双脱氧测序方法示意图;双脱氧法测序原理示意图;（二）DNA序列测定的策略

1、测序载体和引物;任何待测DNA序列的片段克隆于上述载体后，都可按克隆位点两侧的载体序列设计和合成寡核苷酸片段作为“通用引物”，该类引物可以与载体DNA序列互补结合，并以待测DNA为模板引导合成新生链，用双脱氧终止法进行序列测定。;载体;（1）鸟枪法将长链DNA片段随机断裂成适于序列测定的片段（300-600bp），断裂方法有超声波处理、核酸酶I法和限制酶切割法。;③用外切核酸酶III消化上述线性DNA（37?C，250核苷酸/min），在不同时间终止反应，可以获得在同一端缺失并依次相差200-250bp的DNA片段。

④用核酸酶S1消化末端的单链，使之成平端，经T4DNA连接酶连接环化，得到一套缺失长度不同的DNA片段克隆；;引物;