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酵母分离和纯化的方案

目录

CATALOGUE

01

准备工作

02

初步分离

03

纯化步骤

04

分析与鉴定

05

应用与评估

06

方案总结

PART

01

准备工作

选取微生物群落丰富的样品，确保其中可能包含多种酵母菌株，便于后续筛选和纯化。

微生物多样性

样品应避免接触化学污染物或抗生素，防止干扰酵母的正常生长和分离过程。

无污染风险

01

02

03

04

优先选择与目标酵母生长环境相似的样品来源，如发酵食品、土壤或植物表面，以提高分离成功率。

环境适应性

确保样品具有代表性，能够反映目标酵母的实际分布情况，避免因采样偏差导致分离失败。

代表性

样品来源选择标准

营养成分配比

pH值调节

培养基需包含碳源（如葡萄糖）、氮源（如蛋白胨）、无机盐（如磷酸盐）和微量元素，以满足酵母生长需求。

根据目标酵母的生长特性，将培养基pH值调节至适宜范围（通常为5.0-6.5），以优化酵母的生长环境。

培养基配制要求

选择性添加物

可添加抗生素或抑制剂以抑制细菌和其他真菌的生长，提高酵母分离的特异性。

灭菌处理

培养基需经过高压蒸汽灭菌或过滤除菌，确保无菌状态，避免杂菌污染影响实验结果。

设备与耗材清单

培养设备

无菌接种环、涂布棒和细胞筛网，用于样品涂布、划线分离和细胞筛选。

分离工具

检测仪器

耗材准备

包括恒温培养箱、振荡培养器和厌氧培养罐，用于提供不同条件下的酵母培养环境。

显微镜、分光光度计和PCR仪，用于观察酵母形态、测定菌液浓度和基因鉴定。

无菌培养皿、离心管、移液枪头及滤膜，确保实验操作的无菌性和准确性。

PART

02

初步分离

样品预处理方法

将采集的样品（如土壤、发酵液）通过无菌研钵研磨或涡旋振荡器充分混匀，确保酵母细胞均匀分散，避免因结块导致分离效率降低。

样品均质化处理

去除杂质与抑菌处理

选择性富集培养

通过离心或过滤去除大颗粒杂质，必要时添加抗生素（如氯霉素）抑制细菌生长，减少对酵母分离的干扰。

使用含糖类（如葡萄糖）或特定碳源（如麦芽提取物）的液体培养基，在适宜温度下振荡培养，促进酵母增殖并抑制其他微生物竞争。

分区划线法

以“Z”字形或螺旋形路径连续划线，适用于高浓度样品，需控制划线力度以避免划破培养基表面。

连续划线法

三线分离法

在平板中央划一条直线，再从其两侧斜向划两条交叉线，通过交叉区域观察酵母菌落形态差异。

通过无菌接种环将样品在平板表面分四区划线，每区火焰灭菌环后继续划线，逐步稀释样品浓度，最终获得单菌落。

平板划线技术

稀释涂布操作

梯度稀释制备

将样品用无菌生理盐水或缓冲液进行10倍系列稀释（如10⁻¹至10⁻⁶），确保最终涂布平板时菌落数在30-300之间。

涂布均匀性控制

涂布后静置使液体吸收，倒置培养以避免冷凝水滴落干扰菌落形成，培养后挑选边缘清晰的单菌落进行纯化。

取稀释液滴加至平板中央，用无菌涂布棒呈“之”字形涂抹，避免反复涂布导致菌落重叠或分布不均。

静置吸收与培养

PART

03

纯化步骤

显色培养基应用

使用含溴甲酚紫等指示剂的鉴别培养基，通过菌落颜色变化快速区分目标酵母与杂菌，提高筛选效率。

平板划线分离法

采用四区划线法降低菌落密度，确保获得独立单菌落，优先选择形态规则、边缘整齐的菌落进行后续纯化。

显微操作辅助筛选

利用显微挑针在低倍镜下选取直径适中、表面光滑的典型酵母菌落，避免霉菌或细菌污染菌落的误选。

单菌落挑选策略

梯度稀释传代技术

根据酵母种类调整传代培养基碳氮比，如酿酒酵母宜采用YPD培养基，而毕赤酵母需补充甲醇诱导蛋白表达。

营养条件调控

传代周期标准化

严格控制传代间隔在48-72小时，超过5代需重新进行单菌落分离以防止菌种退化。

将菌悬液进行10倍系列稀释后涂布，避免高浓度接种导致的菌落融合，每代培养需记录菌落形态一致性。

传代培养优化

污染检测与控制

01

定期取样进行革兰氏染色，酵母应为革兰阳性卵圆形细胞，出现杆状或丝状结构提示细菌/霉菌污染。

在培养基中添加氯霉素（抑制细菌）和放线菌酮（抑制霉菌），通过生长情况判断污染源类型。

设计真菌ITS通用引物和细菌16SrRNA引物进行扩增，电泳出现非目标条带则判定存在交叉污染。

02

03

革兰氏染色镜检

抗生素耐受性测试

PCR快速检测法

PART

04

分析与鉴定

形态学观察要点

菌落形态特征

观察酵母菌落在固体培养基上的颜色、质地、边缘形状及隆起程度，记录其是否呈现光滑、粗糙、粘稠或干燥等特性，以初步区分不同菌种。

细胞显微结构

生长动态分析

通过光学显微镜或电子显微镜观察酵母细胞的形状、大小、出芽方式及有无荚膜等，结合革兰氏染色结果判断其分类学特征。

监测酵母在不同培养基上的生长速度、菌落直径变化及产孢情况，辅助判断其生理特性及环境适应性。

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2

3

生化特性测试