转基因小鼠的方法概述.docxVIP

转基因小鼠的应用及其制备方法

学院：动物科技学院

专业班级：

学生姓名：

学号：

指导老师：

时间：2015年12月17日

老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都弄懂，愿老师见谅。

鼠交配后进入假孕状态。对于小鼠来说，交配是已知能使子宫为植入受精卵做好准备的唯一方法。移植3星期后，养母便繁殖出从接种受精卵发育而来的幼鼠。

为了鉴定转基因动物，从小鼠的尾巴提取的DNA进行Southern杂交或者PCR，可以确定转基因的存在。转基因小鼠之间交配以确定转基因是否存在首建鼠（founder）的生殖细胞中，随后，进一步杂交培育出纯合转基因品系。

这种方法虽然简单，但需要许多实验步骤。即使是一个操作熟练的工作人员，最多只能使5%的移植受精卵发育成转基因动物[图2-2]。在这个过程中，没有一个步骤的效率可达100%，因此必须使用大量的受精卵进行显微注射。以小鼠为例，注射后大约有66%的受精卵能够存活，25%的移植卵能够发育成小鼠，而其中约有25%的小鼠是转基因个体。因此从1000个受精卵中，只能产生30～50个转基因小鼠。另外，这种方式注射的DNA随机整合到基因组中，并且常在同一位点以多拷贝的形式存在，所以并不是所有的转基因小鼠都具有预期的特性。某些个体中，由于整合位点的缘故可能使转基因不表达；另一些个体中，拷贝数过多可能导致过量表达，因而扰乱了动物正常的生理功能。尽管这种方法效率那很低，但DNA显微注射法还是建立有功能的转基因小鼠品系的常规方法。

图1-1利用逆转录病毒载体建立图2-1利用显微注射的方法构转基因小鼠品系转基因小鼠品系

工程化胚胎干细胞

从发育的小鼠胚胎中获得的胚胎期（blastocyststage）细胞,能够在细胞培养基中繁殖，并在导入另一个胚泡时，保持分化成其他各种类型细胞（包括生殖系细胞）的能力，这类细胞称为全能性胚胎干细胞（ES）。培养的ES细胞易于进行遗传工程改造而不改变其全能性。利用这个系统，有功能的转基因可以整合在ES细胞的基因组中某个非必须基因的特定位点。然后，选择和培养这些基因工程细胞，并用来产生转基因动物[图3-1]。采用这种方法，就可以避免DNA显微注射法和逆转录病毒转染法中随机整合的缺点。

利用染色体特意位置整合的DNA载体转染培养的ES细胞时一些细胞中的DNA整合发生在非靶位点（错误位点），另一些细胞中整合发生在靶位点（正确位点），而大多数ES细胞中根本没有发生整合。采用一种正负选择方法，来富集正确整合的ES细胞。其策略是采用正选择获得正确整合的细胞，而负选择剔除错误整合的细胞。

靶位点必须位于基因组的非必需基因中，这样才能在外院DNA整合后，对细胞发育和功能没有影响。另外，转基因还必须整合在基因组中正常转录的部位。研究人员一直在寻找这种位点。

正负选择方法中应用的DNA载体通常包括：①与靶位点的两个位置同源的两个DNA序列区（HB1和HB2）；②转入的基因（transgene）赋予受体新的功能；③化合物G-418的抗性基因（Neor）；④来自I型、Ⅱ型单纯疱疹病毒（HSV-tk1和HSV-tk2）编码胸苷激酶（thymidinekinase）的两个不同基因（tk1和tk2）[图3-2（a）].这一序列的组合是这一方法中的关键元素。在于靶位点同源的两个DNA序列间是转基因的G-418抗性基因（Neorgene），两个同源区外是HSV-tk1和HSV-tk2基因。如果整合发生在错误位点（不在HB1和HB2上），HSV-tk基因很可能与其他序列整合[图3-2(a)]。相反，如果整合是通过靶位点双交换的基因重组，HSV-tk基因将被剔除，只有转基因和Neor基因整合在基因组上[图3-2(b)]。转染的细胞在G-418存在情况下生长时，缺少Neor基因的细胞将被杀死。因此，只有整合了目的DNA的细胞才能存活，这是正选择。同时加入更昔洛韦[9-(1,3,-二羟基-2-丙氧甲基)-鸟嘌呤]和G-418时，由于胸苷激酶能将更昔洛韦转变为杀死细胞的毒素，所以表达胸苷激酶的细胞就会死亡，这是负选择。双重选择下存活的就是正确整合的细胞。虽然并不是很简单，但这种正负选择方法能从ES细胞群体中富集在染色体特定位点整合转基因的细胞。

更为直接判断ES细胞是否在染色体靶位点携带转基因的方法是采用PCR鉴定。这种情况下，DNA载体含有两段与靶位点同源的DNA区段，分别位于转基因和一段克隆的细菌基因（或人工合成的特有基因，在小鼠基因组中不存在）的两侧[图3-3]。转染ES细胞