细胞因子及抗体检测技术.pptVIP

背景知识;现在是2页\一共有40页\编辑于星期二;抗体检测技术

免疫酶技术

免疫荧光技术

间接血凝试验

放射免疫测定

蛋白印迹

免疫共沉淀

亲和力测定

;酶联免疫吸附测定实验

(ELISA)

Enzymelinkedimmunosorbentassay;;管晓虹（1946-2012），女，汉族，江苏丹阳人，博士，教授，博士生导师。农工民主党员。农工民主党第十二、十三届中央常委，第九、十届全国人大代表，江苏省妇联副主席。;实验原理;实验原理;方法类型;现在是10页\一共有40页\编辑于星期二;;一、试剂及仪器准备;⑵载体性能比较

要求：载体材料+、-结果差别大

检测方法：10ug/LIgG包被,加酶标抗IgG，显色后，测20孔的OD，要求CV10%

⑶常用载体：

材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等

形状：小试管、小珠、微量反应板

;2.Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高

3.免疫吸附剂(固相Ag或Ab)：

包被：将Ag或Ab固相化的过程包被缓冲液、包被方法

封闭：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特异吸附的干扰

;㈡酶结合物：

1.要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定

2.常用酶：HRP、AP、?-半乳糖苷酶等

3.底物：

HRP可溶性底物及呈色：

邻苯二胺(OPD)：橙红(492nm)；四甲基联苯胺(TMB)：蓝色(450nm)

5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm)鲁咪诺+H2O2：荧光

HRP不可溶性底物及呈色：

DAB：棕黄色α-萘酚：红色3-氧基-9-乙基卡唑：红色4-氯-1-萘酚：灰蓝色

AP可溶性底物及呈色：

对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm)4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)：荧光

AP不可溶性底物及呈色：

NBT和BCIP混合液：紫色坚固红和萘酚ASMX混合液：红色

?-半乳糖苷酶：

4-甲基伞基-?-半乳糖苷：荧光

;4.酶结合物的制备：

戊二醛交联法

过碘酸盐氧化法

;（三）设备：酶标比色仪简称酶标仪

指测读ELISA光度计；针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计

性能指标：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性

优良的酶标仪的读数一般可精确0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%

操??：室温宜在15-30℃，使用前先预热仪器15-30min，测读结果更稳定。测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读;现在是18页\一共有40页\编辑于星期二;二、操作步骤

（间接ELISA法）

;（一）样品的收集和保存：;（二）包被;

;最适工作浓度的选择

可用棋盘滴定法在夹心ELISA法中选择包被抗体和酶标抗体工作浓度，即利用棋盘滴定，将包被抗体和酶标抗体稀释成一系列浓度，反应后显色。阳性值在0.8左右，阴性值小于0.1为最适，可据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度

;方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原的工作浓度用包被液将抗原作一系列稀释(1:50～l:800)后，按行进行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液1:100稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照)，保温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，加酸终止反应后读取A值。选择强阳性参考血清A值；为0．8左右，阴性参考血清A值0．1的包被抗原稀释度为工作浓度

;（三）封闭;（四）加样（抗原或抗体）;对照设定;（五）加酶标抗体;（六）显色

;（七）结果判定;

定性测定

定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义

在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔;2.定量测定

ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。

测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。

;现在是33页