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突变型猪表皮生长因子在毕赤酵母中的表达机制与优化策略研究

一、引言

1.1研究背景与意义

猪表皮生长因子（porcineepidermalgrowthfactor，pEGF）是猪乳中含量较为丰富的一种生长因子，由53个氨基酸组成的单链多肽，分子质量约为6ku。作为一种强有力的细胞有丝分裂原，pEGF具有刺激细胞分裂、增殖与分化、促进离子交换和细胞外基质合成等多种重要的生物学特性。在猪的生长发育过程中，pEGF发挥着不可或缺的作用。研究表明，pEGF有利于猪早期胚胎发育，能够提高母猪的窝产仔数和仔猪成活率。对于早期断奶仔猪而言，pEGF的作用更为关键。早期断奶仔猪面临着生理、营养和环境等多方面的适应性难题，如胃酸分泌量显著下降，胃蛋白酶、胰蛋白酶等消化酶的活性降低，肠道黏膜形态和功能发生变化，肠绒毛萎缩、隐窝加深，肠道屏障功能降低，容易受到病原体的侵袭。而pEGF能够刺激干细胞分化和增殖，增强细胞黏附和迁移，促进肠道免疫和吸收功能，有效促进肠道健康发育，对改善早期断奶仔猪的胃肠道发育和生长性能具有重要意义。

随着生物技术的不断发展，利用基因工程技术表达外源蛋白成为了研究的热点。毕赤酵母表达系统作为一种优秀的真核表达系统，在过去的几十年中得到了广泛的应用和深入的研究。毕赤酵母属于甲醇营养型酵母，能够将甲醇作为唯一碳源。该表达系统具有诸多优势，拥有目前最强、调控机理最严格的启动子之一——醇氧化酶基因AOX1启动子，这使得外源基因的表达能够得到精确调控；具有翻译后的蛋白加工修饰功能，如磷酸化、糖基化等，能够对表达的外源蛋白进行修饰，使其更接近天然产物；既可以在细胞内表达，也可在细胞外表达，具有较高的表达灵活性；培养基成本低廉，培养条件简单，生长繁殖速度迅速，有利于大规模发酵生产；外源基因可以单拷贝或者多拷贝的形式在特定的位点整合进酵母染色体上，伴随着染色体的复制而复制，具有较高的遗传稳定性。这些优势使得毕赤酵母表达系统成为了表达外源蛋白的理想选择。

目前，虽然已经有一些关于猪表皮生长因子表达的研究，但是在表达效率和生产成本等方面仍存在一些问题。例如，在原核表达系统中，pEGF的表达可能会受到内毒素难以除去的问题，并且无法对蛋白进行有效的翻译后修饰；在其他真核表达系统中，可能存在表达量低、生产成本高、病毒和支原体污染等问题。因此，研究突变型猪表皮生长因子在毕赤酵母中的表达，具有重要的理论和实践意义。从理论层面来看，有助于深入了解pEGF的结构与功能关系，以及毕赤酵母表达系统对外源蛋白表达的影响机制，丰富基因工程和蛋白质表达的相关理论知识；从实践角度而言，通过优化表达条件，实现突变型pEGF的高效表达，能够为其在畜牧和医药领域的应用提供充足的原料，降低生产成本，具有显著的应用价值和社会经济效益。在畜牧领域，可作为饲料添加剂，改善早期断奶仔猪的生长性能，提高饲料转化率，降低腹泻率，减少养殖成本，促进养猪业的可持续发展；在医药领域，可能用于开发新型的生物药物，用于治疗皮肤损伤、胃肠道疾病等，为人类健康提供新的治疗手段。

1.2研究目的与内容

本研究旨在利用毕赤酵母表达系统实现突变型猪表皮生长因子的高效表达，并对其表达条件进行优化，分析影响表达的因素。具体研究内容如下：

构建突变型猪表皮生长因子的毕赤酵母表达载体：通过基因工程技术，将突变型猪表皮生长因子基因克隆到毕赤酵母表达载体中，构建重组表达载体。对载体进行测序验证，确保基因序列的准确性。

转化毕赤酵母并诱导表达：将构建好的重组表达载体转化到毕赤酵母感受态细胞中，通过筛选获得阳性转化子。对阳性转化子进行培养，在甲醇的诱导下，使突变型猪表皮生长因子基因在毕赤酵母中表达。

表达产物的鉴定与分析：对诱导表达后的产物进行SDS电泳分析，检测蛋白的表达情况；采用Westernblot技术，进一步鉴定表达的蛋白是否为突变型猪表皮生长因子；通过活性测定，分析表达产物的生物学活性。

优化表达条件：研究不同的诱导时间、诱导温度、甲醇浓度等因素对突变型猪表皮生长因子表达的影响，优化表达条件，提高表达量和表达产物的活性。

1.3国内外研究现状

在猪表皮生长因子的研究方面，国内外学者已经取得了一定的进展。研究发现pEGF在猪的生长发育过程中发挥着重要作用，如促进早期胚胎发育、提高母猪的窝产仔数和仔猪成活率、促进断奶仔猪的生长等。在表达方面，已有在原核生物和单细胞生物中表达pEGF及其生物活性鉴定的相关报道。然而，原核表达系统存在内毒素难以除去、无法对蛋白进行有效翻译后修饰等问题，限制了pEGF的应用。

在毕赤酵母表达系统的研究方面，近年来取得了众多成果。该系统凭借其营养要求低、可高密度发酵、遗传稳定性高以及拥有高效的AOX1启动子