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免疫组化实验操作流程及常见问题解析

免疫组织化学技术，常简称为免疫组化，其核心在于利用抗原与抗体特异性结合的基本原理，借助化学显色手段，将组织或细胞内的目标抗原清晰地展示出来。这项技术在病理诊断、生物学研究等领域扮演着不可或缺的角色。实验操作的每一个环节都可能对最终结果产生深远影响，因此，规范操作流程并对常见问题进行有效解析，是确保实验成功的关键。

一、免疫组化实验操作流程

（一）组织样本准备与预处理

组织样本的质量直接关系到后续实验的成败。通常，我们会采用福尔马林进行固定，固定的目的是尽可能保持组织的原有结构和抗原性。固定时间和温度需要严格把控，过长或过短都会带来问题。固定后的组织需经过脱水、透明等步骤，最终用石蜡包埋成块。

切片环节，需使用轮转式切片机将石蜡块切成厚度适宜的切片，一般在几微米左右。切好的切片要平整地贴附在载玻片上，为了防止后续处理过程中脱片，载玻片通常需要进行防脱处理，比如使用多聚赖氨酸包被的玻片。

切片完成后，接下来是脱蜡与水化。这一步骤的目的是去除石蜡，使组织重新回到水相环境，以便后续试剂能够渗透。通常使用二甲苯进行脱蜡，由于石蜡在二甲苯中的溶解度较好，但需注意控制时间，避免组织过度收缩。脱蜡后，再依次经过不同浓度的乙醇溶液，从高浓度到低浓度，最终过渡到水。每一步的浸泡时间和乙醇浓度梯度都需要遵循标准操作，以确保水化完全。

（二）抗原修复

由于组织在固定和包埋过程中，抗原位点可能会被遮蔽，因此抗原修复是免疫组化实验中非常重要的一步，其目的是暴露被掩盖的抗原决定簇，提高检测的灵敏度。

常用的抗原修复方法有热修复和酶修复。热修复是目前应用较为广泛的方法，常用的修复液有柠檬酸盐缓冲液、EDTA缓冲液等，具体选择哪种缓冲液以及其pH值，需要根据抗体的特性和组织类型来决定。热修复可以采用微波炉加热或高压锅加热的方式，关键在于控制修复液的温度和加热时间，避免温度过高或时间过长导致组织形态破坏，同时也要确保修复充分。

酶修复则是利用蛋白酶的作用，分解部分蛋白质，从而暴露抗原位点。常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶等，酶的浓度、孵育温度和时间是影响修复效果的重要因素，需要通过预实验进行优化。

（三）内源性过氧化物酶阻断

组织细胞中通常含有内源性过氧化物酶，它会与后续显色过程中使用的过氧化物酶底物发生反应，导致非特异性染色，干扰实验结果。因此，在进行抗原抗体反应之前，需要阻断内源性过氧化物酶的活性。

最常用的方法是使用过氧化氢溶液。一般将切片浸泡在一定浓度的过氧化氢溶液中，室温孵育一段时间。过氧化氢的浓度和孵育时间要适中，浓度过高或时间过长可能会损伤抗原，浓度过低或时间过短则无法有效阻断内源性酶活性。

（四）封闭

为了减少非特异性抗体的结合，降低背景染色，在加入一抗之前需要进行封闭处理。封闭液通常选用与二抗来源相同的正常血清，或者使用牛血清白蛋白（BSA）等。

封闭液要均匀覆盖组织切片，孵育时间一般在室温下半小时左右。封闭的目的是让封闭液中的蛋白质占据组织切片上的非特异性结合位点，从而减少一抗的非特异性吸附。

（五）一抗孵育

一抗孵育是免疫组化实验的核心步骤，其特异性结合是检测目标抗原的基础。首先，根据抗体说明书的要求，用适当的稀释液将一抗稀释至工作浓度。抗体的稀释比例非常关键，过高会导致信号减弱，过低则可能增加非特异性染色。

将稀释好的一抗均匀滴加在组织切片上，确保完全覆盖组织。孵育条件通常有室温孵育和4℃孵育两种。室温孵育时间相对较短，但可能非特异性结合会稍多；4℃孵育时间较长，一般需要过夜，但特异性更好，背景也相对较低。孵育过程中要注意保持切片的湿润，避免抗体干涸。

（六）二抗孵育

一抗孵育完成后，需要用PBS缓冲液充分洗涤切片，以去除未结合的一抗。洗涤的次数和时间要足够，通常为3次，每次几分钟，洗涤不充分会导致背景升高。

洗涤后，滴加与一抗种属对应的二抗。二抗通常标记有酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶）或荧光素。二抗的孵育条件和时间也需要严格按照说明书进行，一般在室温下孵育半小时左右。同样，孵育后也需要用PBS充分洗涤。

（七）显色

显色是将抗原抗体反应的结果可视化的过程。如果二抗标记的是辣根过氧化物酶，则常用DAB（3,3-二氨基联苯胺）作为显色底物，在过氧化物酶的作用下，DAB会产生棕黄色沉淀。显色时间需要在显微镜下密切观察，待阳性信号清晰且背景未明显升高时，立即用蒸馏水终止显色。

如果二抗标记的是碱性磷酸酶，则常用BCIP/NBT等作为显色底物，产生蓝色或蓝紫色沉淀。显色的程度和时间控制非常重要，直接影响结果的判读。

（八）复染

为了更好地显示组织细胞的形态结构，衬托阳性信号的位置，通常需要进行复染。常用的复染剂是苏木素，它可以将细胞核染成蓝色。复染时间一般较短，几秒到几十秒不等，复染后用自来水或弱碱性溶液返蓝，