动物组织细胞总RNA的提取实验原理及步骤.pdfVIP

实验十一动物组织细胞总RNA的提取

一、实验原理

RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子

生物学中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必

需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取

决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以

在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与

RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他

细胞组分分离，得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase

活性，保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用

RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源RNase活性。提

取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase活性。

并有助于除去非核酸成分。

本实验介绍异硫氰酸胍法和TRIzol法提取动物组织总RNA并通过电泳进行

鉴定。

二、仪器和试剂

1.仪器：

超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、

振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管、

玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用0.1%

DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高压20min，再70～80℃烘烤干燥方可

使用。

2.试剂：

(1)细胞裂解液：

异硫氰酸胍4mol/L

柠檬酸钠（pH7.0）25mmol/L

十二烷基肌氨酸钠0.5%

β-巯基乙醇0.1mol/L

1

称取柠檬酸钠0.64g，十二烷基肌氨酸钠0.415g，吸取β-巯基乙醇0.7ml，

用无Rnase的蒸馏水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，

异硫氰酸胍25g,混合，完全溶解后4℃保存备用。

(2)10×凝胶缓冲液：

吗啉代丙璜酸（MOPS）（pH7.0）200mmol/L

NaAc100mmol/L

EDTA(pH8.0)10mmol/L

过滤除菌后避光保存。

（3）5×变性上样缓冲液：

水饱和的溴酚蓝16μl

500mmol/LEDTA(pH8.0)80μl

甲醛（37%）720μl

甘油2ml

甲酰胺3084μl

10×凝胶缓冲液4ml

加无RNase水至10ml，4℃可保存3个月。

（4）TRIzolRNA抽提试剂

（5）2mol醋酸钠

（6）0.1%DEPC

(7)平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）

（8）平衡酚、氯仿

（9）无水乙醇、70%乙醇、异丙醇

(10)无RNase水

三、操作步骤

（一）异硫氰酸胍法（PLT）

1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液

1ml,在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一

试管中。

2

2.加入2mol醋酸钠（pH4.0）120μl，充分混匀。

3.加入1.2ml酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振10s，冰浴15min。