CN107208056B 原始肠内胚层细胞及其制作方法 （公立大学法人横滨市立大学）.docxVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利

(45)授权

(10)授权公告号CN107208056B公告日2021.07.30

(21)申请号201580066955.X

(22)申请日2015.12.08

(65)同一申请的已公布的文献号申请公布号CN107208056A

(43)申请公布日2017.09.26

(30)优先权数据

2014-2486942014.12.09JP

(85)PCT国际申请进入国家阶段日2017.06.09

(86)PCT国际申请的申请数据

PCT/JP2015/0843792015.12.08

(87)PCT国际申请的公布数据

WO2016/093222JA2016.06.16

(73)专利权人公立大学法人横滨市立大学地址日本神奈川

(72)发明人武部贵则谷口英树张冉冉

(74)专利代理机构中国贸促会专利商标事务所有限公司11038

代理人郑天松

(51)Int.CI.

C12N5/074(2006.01)

C12N5/10(2006.01)

审查员毛舒燕

权利要求书1页说明书20页附图22页

(54)发明名称

原始肠内胚层细胞及其制作方法

(57)摘要

CN107208056B本发明提供用于廉价稳定并且大量地诱导人器官细胞的基盘技术。也提供在使多能性干细胞分化之后，实施至少1次以上传代之后诱导的细胞，其中，作为未分化(多能性)细胞标志物的NANOG,OCT4,MYC,LIN28A是阴性，作为内胚层细胞标志物的CXCR4,CER1,HHEX,GATA4是阴性，作为肠内胚层细胞标志物的CDX2,HOXB9是阳性，再者，作为间充质细胞标志物的Brachyury(T)是阴性，作为胰腺细胞标志物的PDX1是阴性，可至少分化为肝细胞、胰腺细胞及肠细胞的细胞。上述细胞的制作方法及扩增方法、使用上述细胞制作

CN107208056B

图1.人iPS细胞来源原始肠内胚层细胞(PGECs)的诱导-扩增-分化法

肺，甲状腺..②

肺，甲状腺..

②PGEC

扩增PGECs

(P1~)

胰腺

PDX

肠

CDX2

GSDMD

HOXB9

MYC

LIN28A

内胚层

祖细胞(EP)/定形

内胚层(DE)

CXCR4CER1HHEX

NANOGOCT4

PGEC诱导

CN107208056B权利要求书1/1页

2

1.原始肠内胚层细胞的制作及扩增方法，其包括：从多能性干细胞、在饲养细胞非存在下、

经如下阶段分化：

在第1阶段，在Rock抑制物的存在下培养，

在第2阶段，在激活素A及Wnt3a的存在下培养，

在第3阶段，在BMP4、bFGF、VEGF及激活素A的存在下培养，

在第4阶段，在BMP4、bFGF、VEGF及激活素A的存在下培养；

之后实施至少1次以上传代；

在传代后的第1阶段或传代初日，在Rock抑制物的存在下培养；及

其后在SFD、5～10ng/ml的FGF2、8～20ng/ml的VEGF、10～40ng/ml的EGF、0.1～1μM的A83-01及1～5μM的Chir99021的存在下培养。

2.通过权利要求1所述的方法得到的原始肠内胚层细胞，其中

作为未分化多能性细胞标志物的NANOG,OCT4,MYC,LIN28A是阴性，

作为内胚层细胞标志物的CXCR4,CER1,HHEX,GATA4是阴性，

作为肠内胚层细胞标志物的CDX2,HOXB9是阳性，

此外，

作为间充质细胞标志物的Brachyury(T)是阴性，

作为胰腺细胞标志物的PDX1是阴性，且

所述细胞至少可分化为肝细胞、胰腺细胞及肠细胞。

3.器官细胞的制作方法，其包括将权利要求2所述的原始肠内胚层细胞向器官细胞分化诱导。

4.将权利要求2所述的原始肠内胚层细胞在任意的阶段冷冻一保存并构建用于制造器官细胞的工作细胞库的方法。

CN107208056B说明书1/20页

3

原始肠内胚层细胞及其制作方法

【技术领域】

[0001]本发明涉及原始肠内胚层细胞及其制作方法，更具体而言，涉及能分化为肝细胞、胰腺细胞及肠细胞的内胚层细胞及其制作方法。

【背景技术