CN102120028A 从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法 （河南科技大学）.docxVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN102120028A

(43)申请公布日2011.07.13

(21)申请号201110055100.0A61P31/04(2006.01)

(22)申请日2011.03.09

(71)申请人河南科技大学

地址471039河南省洛阳市涧西区西苑路

48号

(72)发明人宫强王帅涛张敏牛明福孙军杰秦翠丽李爱江

(74)专利代理机构洛阳市凯旋专利事务所

41112

代理人符继超

(51)Int.CI.

A61K39/102(2006.01)

C12N1/20(2006.01)

C08B37/00(2006.01)

权利要求书3页说明书8页

(54)发明名称

从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法

(57)摘要

CN102120028A一种从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法，经过①制备禽多杀性巴氏杆菌培养液、②从禽多杀性巴氏杆菌培养液中收集禽多杀性巴氏杆菌菌体、③超声波对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行破碎、④从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖溶液、⑤从粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液、⑥用DNA酶和RNA酶来酶解脂多糖浓缩液中的DNA和RNA、⑦制备纯化的脂多糖和⑧将纯化的脂多糖制作成禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗共八个步骤。经动物免疫实验和动物攻毒实验，本发明制备出的禽多杀性巴氏杆菌病脂多糖疫苗给鸡进行三次免疫之后

CN102120028A

CN102120028A权利要求书1/3页

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1.一种从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法，该方法经过①制备禽多杀性巴氏杆菌培养液、②从禽多杀性巴氏杆菌培养液中收集禽多杀性巴氏杆菌菌体、③超声波对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行破碎、④从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖溶液、⑤从粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液、⑥用DNA酶和RNA酶来酶解脂多糖浓缩液中的DNA和RNA、⑦制备纯化的脂多糖和⑧将纯化的脂多糖制作成禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗共八个步骤，上述八个步骤中所述的②中涉及到离心机的离心转速，所述的③中涉及到超声波的功率、辐射时间、间歇秒数和辐射次数，所述的⑤中涉及到换水次数，所述的⑥中涉及到酶解时间，所述的⑦中涉及到用浓度为6摩尔/升NaOH来调节溶液的pH值，所述的⑧中涉及到脂多糖溶液与弗氏完全佐剂的体积比均为常规实验技术手段，这些常规实验技术手段中的任一项作为单独实验条件或许是存在的，但这些常规实验技术手段综合应用在“从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法”则是必需的；其特征是：所述的八个步骤分述如下：

①制备禽多杀性巴氏杆菌培养液

用接种环刮取一环斜面保藏的禽多杀性巴氏杆菌，将刮有一环禽多杀性巴氏杆菌的接种环以“Z”字型划线接种于培养平板上，将培养平板放置于37℃培养箱内培养24小时，挑取培养24小时后的培养平板上生长的一个单菌落接种于5毫升的液体培养基中，将该5毫升的液体培养基放在37℃的摇床中以160转/分钟的速度振荡培养24小时，再将振荡培养的5毫升液体培养基全部倒入200毫升的液体培养基中并在37℃的摇床中以160转/分钟的速度振荡培养24小时制备出禽多杀性巴氏杆菌培养液；

②从禽多杀性巴氏杆菌培养液中收集禽多杀性巴氏杆菌菌体

将上述①制备出的禽多杀性巴氏杆菌培养液加入到250毫升的离心管中，将加入禽多杀性巴氏杆菌培养液的该250毫升离心管放在离心机上并在5000转/分钟的转速下离心15分钟，然后将离心15分钟后的250毫升离心管中的上清液弃掉，留在该250毫升离心管中的沉淀物就是所收集的禽多杀性巴氏杆菌菌体；

③超声波对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行破碎

在上述②中250毫升离心管所收集的禽多杀性巴氏杆菌菌体中加入10毫升的蒸馏水，然后将该250毫升离心管置于超声波破碎仪中，设置超声波破碎仪的功率为500瓦，每超声波辐射20秒后停止辐射20秒为一个破碎循环过程，所有破碎循环过程共持续30分钟，30分钟后该250毫升离心管中得到的就是经超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体；

④从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖溶液

从禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖分为三步，三步分述如