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黄皮叶绿素酶(CLH)家族基因克隆与表达分析

1.引言

黄皮（Clausenalansium）是芸香科黄皮属植物，具有重要的经济和药用价值。叶绿素酶（Chlorophyllase，CLH）在植物叶绿素降解过程中起着关键作用，它能够催化叶绿素水解生成脱植基叶绿素和植醇。对黄皮CLH家族基因进行克隆与表达分析，有助于深入了解黄皮叶绿素降解的分子机制，为黄皮果实的采后保鲜和品质调控提供理论依据。

2.材料与方法

2.1实验材料

选取生长健壮、无病虫害的黄皮植株，采集不同发育阶段的叶片、花和果实等组织，迅速用液氮冷冻后，置于80℃冰箱保存备用。

2.2总RNA提取与cDNA合成

采用改良的CTAB法提取黄皮各组织的总RNA。用核酸蛋白分析仪检测RNA的浓度和纯度，用凝胶电泳检测RNA的完整性。以提取的总RNA为模板，使用反转录试剂盒合成第一链cDNA。

2.3黄皮CLH家族基因的克隆

根据其他植物已知的CLH基因序列，设计简并引物。以黄皮cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系和程序如下：

反应体系（25μL）：cDNA模板2μL，上下游引物各1μL，dNTPMix2μL，10×PCRBuffer2.5μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，ddH?O16.3μL。

反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min