小RNA测序文库制备及目标富集方法.pdfVIP

小RNA和目标富集方法

发明简述

本发明的一个方面是为Illumina准备小RNA（微RNA、snRNA、snoRNA、piRNA等）的方

法，该方法通过在小RNA的3端连接多聚A尾巴，然后使用多聚T引物进行第一链c合成，接着利用

逆转录酶的末端转移酶活性在第一链c的3端添加几个胞嘧啶，最后使用带有(G)3作为退火引物的非

模板核苷酸合成第二链。

本发明的另一个方面是在c模板的5和3端添加非模板突出端，以作为Illumina扩增的通

用引物。

本发明的另一个方面是通过RCA进行小RNA目标富集的方法，该方法在非模板区域包含一个发夹限制

性酶识别位点。

本发明的另一个方面是通过几轮PCR扩增双链c，其中一条引物带有生物素标记，另一条引物带有磷

酸基团，随后通过链霉亲和素珠结合试验去除生物素标记的链，再通过circlase（MCLAB）进行5磷酸化

链的环化，然后使用与目标小RNA序列互补的引物进行RCA扩增，最后通过限制性内切酶切割长RCA链，

得到两端带有通用引物的单链。

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