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2025年基因编辑与细胞培养手册

第1章基因编辑工具与系统

1.1CRISPR-Cas9与Cas12酶学特性解析

CRISPR-Cas9系统利用Cas9核酸酶在基因组特定位点精准切割双链DNA，其核心识别序列为PAM（ProtospacerAdjacentMotif），通常位于目标位点上游3-4个碱基处，且PAM序列必须为NGG（其中N为任意碱基）。在2025年的实验室实践中，我们常使用SpCas9或HmCas9变体，SpCas9对G碱基有天然偏好，而HmCas9因缺乏G偏好性，其在T或C位点附近的切割效率显著提升，特别适合编辑含有G的基因簇。Cas12a（Cpf1）酶属于I型内切酶，其识别序列为TTTT/TTGG，且紧邻的PAM序列为TTT/TGG，与CRISPR-Cas9的NGG不同。Cas12a切割后会产生5磷酸基团和3羟基末端的平末端DNA片段，这使得后续连接反应无需额外的磷酸化酶处理，简化了操作流程。Cas12a不需要PAM序列，这意味着它可以在不依赖特定PAM的情况下切割任何DNA序列，极大地扩展了编辑策略的灵活性。

在脱靶效应评估中，Cas9系统常因PAM序列的随机性导致非特异性切割，而Cas12a由于PAM特异性强，其脱