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生物技术原理与应用指南手册（执行版）

第1章生物技术的定义与理论基础

1.1基因工程的核心机制

基因工程的核心在于利用分子生物学工具，将外源基因导入受体细胞，使其在代谢或遗传上产生新性状。这一过程始于对目的基因（如胰岛素基因、抗虫Bt基因）的精确切割，通过限制性内切酶（如EcoRI,BamHI）识别DNA上的特定回文序列（如GAATTC），将线性DNA片段从载体（如质粒pUC19）上分离出来。载体分子作为“运输工具”，必须具备复制原点（ori）以确保在宿主细胞内自主复制，并携带选择标记（如抗生素抗性基因）用于筛选成功转化的细胞。科学家利用连接酶将目的基因片段与载体片段在黏性末端或平末端处连接，形成重组DNA分子，此时载体上会插入外源基因。

将重组DNA导入受体细胞通常采用显微注射法（用于受精卵）、电转化法（利用高压脉冲使细胞膜暂时穿孔形成通道）或化学转化法（如钙离子处理）。一旦进入细胞，外源基因需进入细胞核才能表达，此时细胞内的DNA复制机制会启动，将重组DNA传递给子代细胞。在体外扩增阶段，利用PCR技术（聚合酶链式反应）可数倍扩增目的基因序列，反应需包含引物设计、热循环程序（95℃变性、55-65℃退火、72℃延伸）及Taq酶循环扩增。扩增后的产物经凝胶电泳检测条带大小，确认基因拷贝数是否符合预期。重组DNA分子