荧光定量PCR技术原理与结果分析.pptVIP

荧光定量PCR技术

原理与结果

分析

罗喜鹏

一、含义

二、优越性

三、应用

四、定量方法

五、荧光材料

六、结果分析

一、含义

实时荧光定量PCR技术(Real-TimeQuantitativePCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

二、优越性

特异性荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。

敏感性荧光定量PCR的敏感度通常达E2拷贝/ml，对数期分析，线性范围很宽，为0-E11拷贝/ml。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-E10/拷贝，在此范围内荧光定量PCR定量较为准确，标本不需稀释。

重复性荧光定量PCR结果相当稳定，因为域值设置在指数扩增期.在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。

自动化无PCR后续操作步骤，降低产物污染的风险性。

三、应用

用于核酸的定量如RNA、DNA的定量

用于核酸定性分析如SNP分析，基因型分析，RNA变异分析，溶解曲线分析等。

四、定量方法

1.

标准曲线法的绝对定量

2.

标准曲线法的相对定量

3.

比较CT法的相对定量

五、荧光材料

荧光探针和荧光染料

SYBR