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基因组编辑新前沿：长片段DNA的精准插入技术

摘要

CRISPR-Cas系统革命性地实现了基因组靶向切割，但其同源定向修复途径介导的长片段DNA精准插入效率低下，限制了其在基因治疗、大片段基因功能研究及合成生物学等领域的广泛应用。近年来，一系列不依赖传统HDR的新型长片段精准插入技术应运而生，旨在克服HDR的效率瓶颈和细胞周期依赖性。这些技术主要分为两大类：基于DNA修复通路工程改造的策略，如通过抑制非同源末端连接关键因子以促进HDR，或利用微同源介导的末端连接等替代修复途径；以及完全绕开双链断裂依赖修复的“切割-粘贴”式转座重组系统，例如CRISPR相关转座酶系统。其中，CAST系统将Cas蛋白的精准靶向能力与转座酶的DNA整合功能相结合，可在不产生DSB的情况下，实现长达数千碱基对供体DNA的定向、无痕插入，且不依赖细胞自身的修复机制，理论上对所有细胞类型有效。此外，基于单链退火蛋白介导的重组、逆转录酶与CRISPR的融合系统等技术也在不断发展。这些新方法在提高插入效率、降低indel副产物、扩展适用细胞类型方面展现出巨大潜力，但也面临着插入精度、脱靶整合、递送挑战及潜在免疫原性等问题。本文系统评述了长片段精准插入的技术原理、代表性系统、比较优势、当前挑战及在基础研究与临床应用中的广阔前景。

关键词

长片段DNA插入；精准基因组编辑；同源定向修复；CRISPR相关转座酶；基因治