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原位杂交作业标准

一、实验前准备

（一）试剂与材料准备

固定剂：常用4%多聚甲醛（PFA），需提前用0.1MPBS（pH7.4）配制，配制过程中注意搅拌均匀，可适当加热促进溶解，冷却后用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存，保存期限不超过2周。也可选用中性缓冲福尔马林（NBF），适用于石蜡包埋组织的固定，固定时间根据组织大小调整，一般为6-24小时。

通透剂：包括TritonX-100、蛋白酶K等。TritonX-100常用浓度为0.1%-0.3%，用PBS配制，主要用于增加细胞膜通透性，使探针更易进入细胞。蛋白酶K需用TE缓冲液（10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0）配制，工作浓度通常为1-5μg/ml，使用前需根据组织类型和固定时间优化浓度，过度消化会导致组织形态破坏，消化不足则会影响探针结合效率。

杂交液：主要成分包括甲酰胺、SSC（柠檬酸钠缓冲液）、硫酸葡聚糖、Denhardts溶液、鲑鱼精DNA等。甲酰胺浓度一般为50%，用于降低杂交温度，减少探针非特异性结合；SSC常用2×或4×浓度，提供适宜的离子强度；硫酸葡聚糖浓度为10%，可提高杂交液的黏度，增加探针有效浓度；Denhardts溶液浓度为1×，包含Ficoll、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白，用于抑制非特异性结合；鲑鱼精DNA需提前煮沸变性，工作浓度为100-200μg/ml，用于封闭组织