基因工程实验.ppt

基因片段与载体连接及重组子的转化;基因片段与载体连接;一、实验目的及背景

;二、DNA分子的体外连接原理

;连接反应中值得注意的几个问题：;T4DNA连接酶作用机制;普通Taq酶会在3′末端加一个A，这样所有PCR产物都会在双链DNA的3′端均有一个单链状态的A；

T－载体是线状DNA片段，在DNA双链的3′端均有一个单链状态的T；

二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，从而达到克隆的目的。

;2.连接反应的温度;3.DNA的平未端和粘性末端;4.碱性磷酸酶处理质粒载体;5.连接反应的检测;三、实验试剂

１．纯化后的酶切质粒载体和目的基因。

２．１０×Ｔ4DNA连接酶buffer

200mMTris-HCl(pH7.6)

50mMMgCl2

50mM二硫苄糖醇

500μl/mlBSA

３．Ｔ4DNA连接酶

４．5mMATP

;四、实验方法

;DNA分子的体外连接：

;五、结果与分析

;问题与讨论：;重组子的转化;一、DNA的转化及转化子的筛选

;二、原理--本实验由二个方面组成:;现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中与外来DNA分子相混合.

DNA分子转化分以下几步:

１．吸附－－双链DNA分子吸附于受体菌表面；

２．转入－－双链DNA分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解；

３．自稳－－外源质粒DN