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微专题11PCR技术和基因编辑技术

1.RT-PCR（逆转录PCR）

常规的PCR过程是由DNA依赖的DNA聚合酶以DNA作为模板进行扩增的，而逆转录PCR则由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。首先，由逆转录酶将RNA单链转录为与其互补的DNA（cDNA），再通过常规PCR和相应引物进行另一DNA链的合成以及DNA双链的扩增。逆转录PCR是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA，广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。

2.重叠延伸PCR技术

重叠延伸PCR是一种通过引物之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。利用重叠延伸PCR可以实现基因的定点突变。如图所示：

①PCR扩增DNA的过程中，PCR1应选择引物F1和R1，PCR2应选择引物F2和R2，第二步中延伸不需引物，通过PCR3大量扩增突变产物应选择引物F1和R2。

②重叠延伸PCR通过在引物R1和F2上引入突变实现定点突变。PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是引物R1和引物F2可以互补配对，导致引物失效。

3.反向PCR技术

（1）条件：当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。

（2）原理：用限制酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化