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基因敲除细胞株构建实验报告

一、实验材料与仪器

（一）细胞系与菌株

本次实验选用人肝癌细胞系HepG2作为基因敲除的靶细胞，该细胞系具有培养条件简单、增殖速度快、基因编辑效率较高等特点，广泛应用于肿瘤生物学及基因功能研究。同时，使用大肠杆菌DH5α菌株用于质粒的扩增与保存，该菌株为常用的克隆菌株，具有重组缺陷型特性，可有效降低质粒的重组概率，保证质粒的稳定性。

（二）载体与工具酶

实验中使用的CRISPR-Cas9载体为pSpCas9(BB)-2A-GFP（PX458），该载体由Addgene公司提供，携带Cas9蛋白编码基因、绿色荧光蛋白（GFP）标记基因以及U6启动子驱动的sgRNA表达框，便于通过荧光显微镜筛选转染成功的细胞。工具酶包括限制性内切酶BbsI、T4DNA连接酶、高保真DNA聚合酶等，均购自NEB公司，酶活性稳定，能够满足载体构建过程中的酶切、连接及PCR扩增等需求。

（三）试剂与耗材

细胞培养试剂主要包括DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素双抗溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液等，均购自Gibco公司。基因编辑相关试剂包括sgRNA合成试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、细胞转染试剂Lipofectamine3000等，分别购自ThermoFisherScientific和OmegaBio-tek公司。实验耗材主要有细