质粒构建全流程详解与实战指导.pdfVIP

质粒构建流程

一、引物设计

1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI

2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。

3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1（+）,

4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两

加入plelutionbuffer于膜上电泳检测三双酶切pl反应体系如下PCR纯化产物XMLKbufferdHO酶A酶BplplplplIplVectorXMLKbufferdHO酶A酶Bplplplplpl反应条件takara酶C水浴hC

个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。

5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。

6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位

点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。

7）引物设计完成，送公司合成。

二、目的片段获取

1.RNA提取

试剂盒：Bioteke高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL