质粒构建全流程详解与实战指导.pdfVIP

质粒构建流程

一、引物设计

1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI

2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可

用没切位点。

eewaterlll可根据RNA浓度调整lPCR仪中进行程序min注RNA的量可根据浓度调整混合液冰上配制酶最后加入反转录反应l体系primerScriptbufferprimerScriptRTenzymemixIRTprimermixR

3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1(+)，

4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为

备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。

5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。

6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两

端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。

7）引物设计完成，送公司合成。

二、目的片段获取

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